葫芦科(Cucurbitaceae)的植物广泛分布于热带和亚热带地区，大多数是人们所喜爱的瓜类蔬菜，如黄瓜(Cucumis sativus L．)、西瓜[Citrullus lanatus(Thunb．)Matsum．et Nakai]、甜瓜(Cucumis melo L)、苦瓜(Momordica charantia L)、南瓜(Cucurbita moschata Duch．ex Poir．)、冬瓜(Benincasa hispida Cogn．)、丝瓜(Luffa cylindrica)，开展瓜类蔬菜转基因技术的研究，对于疏菜育种、病虫害防治及品种改良具有重要的意义。近年来瓜类蔬菜转基因研究方面取得了显著进展，笔者就瓜类蔬菜转基因体系以及外源基因的遗传转化研究进展进行综述。

1  再生系统的建立

    建立一个高效、稳定的再生系统，是植物遗传转化成功的前提条件。瓜类蔬菜的再生途径通常采用器官分化途径和体细胞胚胎发生途径。

1．1器官分化途径

器官分化途径是瓜类蔬菜进行外源基因遗传转化时的一个主要途径，常用的外植体是子叫‘和子叶节。通过器官分化出不定芽建立再生系统，具有再生周期短、避免体细胞变异等特点。日前，通过器官分化途径作为遗传转化的研究已有不少成功的报道。如黄瓜(王艳蓉等，2006)、西瓜(王慧中等，2000a)、甜瓜(王慧中等，2000b；李晓荣，2002)、葫芦(Han et a1．，2005)、苦瓜(林义章和罗燕华，2007)等都已经获得了转基因植株。

1．2体细胞胚胎发生途径

与器官分化途径相比，体细胞胚胎发生途径具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等特点，进行遗传转化时植株出现嵌合体的情况较少，转基因植株很容易鉴定出来。但是利用体细胞胚胎发生途径进行转基因的报道较少。Akasaka-Kennedy等(2004)以甜瓜的两个品种Vedrantais和Earl's Favourite Fuyu A的成熟胚为材料，经过悬浮培养诱导出了体细胞胚胎，并对品种Vedran— tais进行了遗传转化。

2转基因的方法

与其他作物相比，葫芦科作物转基因研究进展相对缓慢。目前导入外源基因的方法有农杆菌介导法、Floral—dip法、花粉管通道法、DNA浸胚法和基因枪法，其中农杆菌介导法是最常用的方法。

2．1农杆菌介导法

    农杆菌介导法是目前双子叶植物遗传转化的主要方法。Fang和Grumet(1990)首次报道了利用根癌农杆菌介导法将新霉素磷酸转移酶基因N一PTII导入甜瓜。

    多数研究者也都采用了根癌农杆菌介导法将外源基因导入瓜类蔬菜，如西瓜(孙玉宏等，2007)、黄瓜(李泠等，2007)、甜瓜(葛屹松等，2003；李晓荣等，2003)、苦瓜(林义章和罗燕华，2007)和葫芦(Han et a1．，2005)，并获得厂转基因植株。

    与其他方法比较，农杆菌介导法比较成熟，且简单、廉价。但此方法必须有一个高频的再生体系，为获得高的转化率，还要对不同的预培养时问、共培养时间、侵染时间、温度及选择压力等因素进行优化(表1)。

2．2 Floral—dip法

农杆菌介导的Floral—dip转化方法是近年发展起来的一种简便、快速、高效、重复性好、稳定性高的非组织培养转基因方法，主要运用于拟南芥T—DNA或转座子捅人突变体库的构建和功能基因组研究(Lawrence&Pikaard，2003；Gspar，2004；Clough，2005；徐芳等，2005)。目前Floral—dip转化方法已成功应用于拟南芥(Tague，2001)、萝卜(Curtis&Nam，2001)、苜蓿(Curtis，2005)、油菜(付绍红等，2004)等植物中。王翠艳等(2008)首次采用Floral—dip法转化黄瓜的两个自交系P2和2M1，在两个自交系中获得_r阳性转化植株，转化率分别为0．55％和0．68％。该研究为Floral—dip法在瓜类蔬菜遗传转化上的应用奠定了基础。

2．3花粉管通道法

    花粉管通道法是20世纪70年代周光宇创建的，与此类似的方法还有子房注射法。董伟和吴勇(1993)采用花粉管通道法将外源DNA导入黄瓜，且获得1×

由于瓜类蔬菜花的柱头较大，所以采用花粉管通道法操作方便，但此法转化频率低，对授粉后的时问要掌握好。由于该方法缺少分子水平上的机理及证据，目前仍存在较大的争议。

2．4 DNA浸胚法

DNA浸胚法是指将供试的种胚浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用将外源基因导人种胚细胞中并稳定地整合表达与遗传。近年来，运用DNA浸胚法获得了大量水稻、玉米、棉花的变异材料和晶系，说明外源DNA浸泡种胚町获得变异后代。肖光辉等(1999a)报道，采用DNA浸胚法将供体瓠瓜的总DNA导入西瓜，得到性状变异的株系，变异株系的子代(T2)呈现出多种变异类型，如果实皮色、果实形状、种子形状、种子色泽等。

2．5  基因枪法

基因枪转化法足将载有外源DNA的钨或金颗粒加速后射入受体细胞巾的一种遗传物质导入技术。任春梅等(2000)以西瓜顶芽为受体建立基因枪介导的遗传转化系统，经组织化学检测表明，有33．3％抗Kan试管苗为GUS阳性。李贞霞等(2005)用黄狼南瓜的愈伤组织作受体进行了基因枪的轰击实验，筛选培养45 d后进行GUS基因组织化学染色，结果表明GUS基凶可在南瓜的组织中瞬时表达。基因枪转化法与其他转化方法相比，具有无宿主限制、受体类型广泛、可控度高、操作简便、快速、转化率高等优点。但该技术的缺点是转入的基因常为多拷贝，表达水平低，会发生转基因沉默和较大片段基因易断裂。

3  目的基因的转化和表达研究

3．1抗病毒病基因的转化

瓜类蔬菜病毒病是世界性的病害，凡种植地区几乎都有发生，严重影响了瓜类蔬菜的产量和品质。而通过基因工程创造出新的种质资源为提高植物的抗性提供了一条新的途径，其中利用最多的一种方法是通过遗传转化将病毒外壳蛋白(Coat Protein，CP)编码基因转入受体细胞中表达。近年来，一些病毒外壳蛋白基因已经成功转入瓜类蔬菜中。王慧中等(2000b，2000c)将WMV一2 CP基因导人黄瓜和甜瓜中，发现转基因植株可以推迟发病时问，减轻发病程度，表现出对WMV一2较强的抗性。导人病毒CP编码基因的南瓜、西瓜在相应的病毒侵染下都表现出小同程度的抗性(Grumet et al.，2000)。

3．2抗真菌病害基因的转化

葫芦科植物的瓜类蔬菜常见的真菌性病害主要有霜霉病、白粉病、枯萎病、疫病和炭疽病等。通过转基因手段获得稳定的抗性材料是抗性育种的一个新途径。肖光辉等(1999b)用DNA浸胚法将瓠瓜的总DNA导入西瓜，获得了抗枯萎病的植株。杨成德(2001)在国内首次朋几丁质酶和p一1，3一葡聚糖酶基因对黄瓜进行转化，经测定，转化植株对枯萎病菌有较强的抗性。张志忠(2004)用含有番茄几丁质酶基冈和B一1，3一葡聚糖酶基因的双价抗真菌基因植物表达载体，用于转化西瓜，离体抗病性鉴定结果表明，转基因植株对枯萎病菌的抵抗能力有不同程度的增强。

3．3抗逆基因的转化

抗逆基因工程的研究主要集中在逆境条件下才能表达的某些基因的研究以及抗逆代谢过程中某些酶的研究。Serrano等(1999)用农杆菌介导法把酵母hla I基因导入甜瓜中，发现转基因甜瓜有较高的耐盐性。转入hla I基因的西瓜也对NaCl胁迫有较高的耐性。Ohkawa等(1994)通过基因枪法将抗坏血酸氧化酶基因导入黄瓜中，结果发现转基因植株抗寒能力显著增强。

3．4  品质改良基因的转化

目前，蔬菜品质的改良已成为蔬菜品种选育的主要日标，一些有价值的外源基因的导入无疑是一条有效的途径。在品质改良方面，转基因技术在瓜类蔬菜上研究较多的是控制瓜类蔬菜(西瓜、甜瓜、黄瓜和苦瓜等)果实成熟、耐贮的ACC合成酶反义基因和ACC解氨酶基因等的研究。工春霞等(1997)通过根癌农杆菌将番茄的ACC合成酶及其反义基因导入到西瓜中，获得的转基因植株的乙烯释放量明显受到抑制。李晓荣(2002)用农杆菌介导法将ACC脱氨酶基冈导入新疆哈密瓜的两个品种皇后和卡拉克塞(伽师瓜)，乙烯测定结果初步证明转基因植株对乙烯(伤乙烯)的生成有抑制作用。李建国(2006)通过反义RNA技术，将ACC合成酶反义基因导入河套蜜瓜中，获得了转ACC合成酶反义基因的耐贮藏河套蜜瓜。樊继德等(2007)用子房注射法将甜瓜反义酸性转化酶基因导人厚皮甜瓜自交系01—3果实中，进一步研究发现，T0转基因植株果实的可溶性糖含量比对照提高了52％，而T1转基因植株果实的可溶性总糖含量提高了26％，蔗糖含量比对照提高了2．5倍，但足果糖和葡萄糖含量略有降低，酸性转化酶活性比对照明显降低。

4存在的问题

4．1再生系统不完善

目前，在瓜类蔬菜子叶离体培养方面，黄瓜、西瓜、甜瓜研究较多，但节瓜、苦瓜、南瓜、冬瓜、西葫芦、笋瓜、瓠瓜等研究较少，菜瓜、蛇瓜、丝瓜、佛手瓜等其他瓜类至今尚未见相关的报道。在子叶离体再生过程中还存在着由愈伤组织分化出芽十分困难，直接分化不定芽分化率较低，且再生体系重复性差等问题。体细胞胚胎发生途径报道较少。建立高效、稳定的再生体系仍然是研究的重点。

4．2转化率和成苗率低

    建立高效的离体再生体系是农杆菌介导法转化的前提条件，外植体的基因型、培养组织类型以及外源激素等内外因素对遗传转化率有很大的影响。外植体的基因型是决定遗传转化率的内因，常常由于不同品种甚至同一品种的转化率存在很大的差异，造成转化率低、重复性差。外植体的类型也足决定遗传转化率的内因，外植体的苗龄、生理状态、不同部位对转化率也有重要影响。外源激素在促使外植体脱分化和再分化方面有重要作用，细胞分裂素单独使用或与生长素配合使用对外植体的再生及生长都有影响。因此，在今后的瓜类蔬菜转基因的研究中，应选出再生能力高的品种，通过自交繁育检测其再生能力，这一过程重复几次后，筛选出具有稳定再生能力的品种。如甜瓜自交系BU一21／3极容易再生，并在以色列广泛应用，这种基因型有望成为甜瓜转基因育种的有效工具(Galperin et a1．，2003)。同时选择易再牛的外植体和添加适宜的外源激素来提高转化率和成苗率。

4．3  基因沉默和转基因植株的性状变异

外源基因沉默与否决定着转基因植株的价值。基因沉默可能与多拷贝的转基因、外源基因的甲基化、插入位点等因素有关。有效防止外源基因的沉默，提高转化率，是建立和完善转化体系的一个苇要研究内容。遗传转化植株性状变化除可能由无性变异引起外，还可能因为外源基因对转基因植物中的非编码性状有影响，经常引起体细胞的变异，使得某些性状发生变异。所转基因也可能与其他基因发生相互作用从而引起性状变异。所以应根据育种目标积极辅以杂交、回交、组培等育种手段创造优良性状，真正达到遗传转化的目标。

4．4转基因植物的安全性

转基因植物安全性问题，一直是人们争论的热点，特别是选择性标记基因的使用，它是决定转基因植物能否向市场投放的一个关键因素。在转基因植株中消除选择性标记基因，可以减少人们过多的忧虑，从而能够更好地推动转基因技术的发展。

5  展望

    葫芦科作物中许多瓜类蔬菜，如西瓜、甜瓜、黄瓜和苦瓜等，具有很高的经济价值，在改良品质，提高抗逆、抗虫和抗病能力等方面有着巨大的潜力。利用转基技术把抗逆、抗虫和抗病等优良性状的基因导入到瓜类蔬菜中去，将为葫芦科作物的遗传育种开辟一条崭新的途径。目前许多国家家为了鼓励和推动这一生物技术的发展，制定和采取了一些新的有利政策及措施，已被批准上市的转基因蔬菜越来越多，如番茄、马铃薯、南瓜、西葫芦等。随着生物技术的不断发展，葫芦科作物离体冉牛体系不断的完善，以及遗传转化体系不断的建立，转基因工程将为瓜类蔬菜的遗传育种、品质改良带来前所未有的突破。

韩伟1，2  刘娥娥1  王亚琴3何晓明2

(1华南农业大学生命科学学院，广东广州510642；

2广东省农业科学院蔬菜研究所，广东广州510640；

3华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510641)

中国蔬菜2010.4