在污水处理过程中，活性污泥中的微生物在净化污水的同时自身也在繁殖增长，必须定期少量排出，以维持污水处理系统中氧的供给，使活性污泥浓度保持在一定水平。排出的这些剩余活性污泥必须加以治理。目前，多采用填埋、焚烧和土地利用等处置方法。其中，土地利用被认为是最具吸引力的污泥处置方法，污泥中高含量的有机物能够为农作物提供营养。然而，污泥中高含量的有毒重金属大大限制了剩余污泥的土地应用。去除剩余活性污泥中的重金属已成为污泥处置技术中的瓶颈问题。

目前，通常使用化学法去除污泥中的重金属，如氯化、离子交换、络合和酸化等。但是化学法具有一定的缺点，如成本高、操作困难、耗能量高、耗酸量大和金属溶解量低等。相比之下，生物淋滤法具有低成本、操作简单、耗能低、金属去除率高且副产物无毒等优点。因此，研究生物淋滤法去除剩余活性污泥中的重金属具有非常重要的价值。生物淋滤法(Bioleaching)是指利用自然界中一些微生物（硫细菌）的直接作用或其代谢产物的间接作用，产生氧化、还原、络合、吸附或溶解作用，将固相中某些不溶性成分（如重金属、硫及其它金属）分离浸提出来的技术。它应用于难浸提矿石或贫矿中金属的溶出与回收又称微生物湿法冶金。

在生物淋滤中，嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，A.f)和嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans，A.t)被用作有效的淋滤载体。这种嗜酸性的化能自养型细菌以大气中的C02为碳源，以无机物铁或硫为能源来维持生长，不需要提供外来的碳源和电子供体。另外，由于pH值很低，抑制了其他细菌的生长，所以在实际的操作过程中不需要严格的无菌条件。氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌去除重金属适宜于污水处理厂的开放系统。一般认为氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌有两种作用机理。第一种为直接机理，细菌通过其分泌的胞外多聚物直接吸附在污泥中金属硫化物(MS)表面，通过细胞内特有的氧化酶系统直接氧化金属硫化物，生成可溶性的硫酸盐。反应如下：

MS+202一MS04(A.f和A.t)

第二种是间接机理，氧化亚铁硫杆菌利用其代谢产物硫酸铁，与金属硫化物发生氧化还原反应。硫酸铁被还原成硫酸亚铁并生成元素硫，金属以硫酸盐形式溶解出来，而亚铁又被细菌氧化为铁。氧化硫硫杆菌把元素硫氧化成硫酸，然后硫酸使金属硫化物溶解。通过生物淋滤，污泥pH下降到2.0左右，这又大大促进了污泥中重金属的溶解。反应如下：

4Fe2++O2+ 4H+—4Fe3++ 2H20(A.f)

MS+2Fe3+一÷

株土著硫杆菌。在分类鉴定的基础上，确立二者分别A.f和A.t。采用二者进行了剩余活性污泥的生物淋滤，对淋滤过程中的pH变化、ORP以及重金属含量进行了检测。研究了利用土著硫杆菌进行生物淋滤的条件。

1材料与方法

1.1剩余活性污泥

剩余活性污泥取自天津市东郊污水处理厂，实验室内于40C保存备用。采用ICP检测了污泥中的重金属含量。检测结果见表1。

1.2硫杆菌的分离

1.2.1嗜酸性氧化亚铁硫杆菌及分离：嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，A.f)从剩余活性污泥中分离纯化得到。采用9K培养基选择性培养分离A f. 100 mL培养基中加入1-2 9剩余活性污泥，于300C振荡培养箱中150 r/min培养7-10 d。分离得到的A.f转移到新鲜的9K培养基中于同样条件下富集培养。采用稀释梯度法纯化A.fo稀释梯度得到的浓度最小(10-8)的菌液，经过纯培养的菌液进行普通光镜和透射电镜镜检。9K培养基配方：(NH4)2804 3.0 9，K2HP04 0.5 9，MgS04"7H20 0.5 9,KC1 0.1 9,Ca(N03)2"4H20

0.01 g，FeS04-7H20 44 9，蒸馏水1000 mL，pH 2.0。1.2.2嗜酸性氧化硫硫杆菌及分离：嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans，A．f)从剩余活性污泥中分离纯化得到。采用硫粉或Na2S203代替9K培养基中的FeS04的方法选择性培养分离。100 mL培养基中加入1-2 9剩余活性污泥，300C、150 r/min振荡培养7-10 d。分离得到的A．t转移到新鲜培养基中于同样条件富集培养。采用平板划线分离法纯化A f。将菌液在固体培养基上划线，300C培养3-5 d，挑取单菌落转移至新鲜液体培养基中，300C、150 r/min振荡培养。菌液通过透射电子显微镜观察。A.t液体培养基配方：(NH4)2S04 3.0 9，K2HP04 0.5 9,MgS04"7H20 0.5 9,KC1 0.1 9, Ca(N03)2"4H20 0.01 9，S10g，蒸馏水1000 mL，pH 3.5-4.0。A．f固体培养基把S更换成Na2S203，并加入3%琼脂。

1.3菌株16S rRNA基因序列分析

菌株的16S rRNA基因序列分析的方法是：首先提取细菌总DNA，然后利用16S rRNA基因的特异扩增引物27F和1492R进行PCR扩增。然后送商业公司进行测序。在GenBank以测序的结果进行比对，构建进化树。

1.4生物淋滤

500 mL三角瓶中含有200 mL淋滤初始液，其成分主要为：(NH4)2S04 0.6 9，K2HP04 0.1 9，MgS04"7H20 0.51 9,KC1 0.02 9,Ca(N03)2"4H20,0.0012 9，蒸馏水200 mL。另外，对于A.f进行的淋滤需要再加入8.8 9 FeS04"7H20;对于A．t进行的淋滤需要再加入2.0 9 S；而对于A.f和A．t混合菌进行的淋滤则要再加入2.0gS和8.8 9 FeS04"7H20。pH以H2S04调至4.0。将A.f菌液、A．t菌液以及A.f和A．t混合菌液按10%（V/V)、10%（V/V)和5%+5%（V/V)分别接种于含有5%（W/V)脱水污泥的200 mL淋滤液中。对照组中不加菌液，只含有5%（W/V)脱水污泥和200mL蒸馏水。3个试验组和一个对照组各重复3次。300C、150r/min进行9d。

1.5分析方法

1.5.1pH检测：采用320-S型pH计（梅特勒一托利多）每24 h对实验组和对照组进行检测。

1.5.2氧化还原电位检测ORP检测：采用ORP-411型测定仪（上海大普）每24 h对实验组和对照组进行检测。

1.5.3重金属含量测定：采用电感耦合等离子体法(ICP)每3d对实验组和对照组进行检测。重金属去除率的计算公式为：

重金属去除率=（淋滤前重金属含量一淋滤

后重金属含量）／淋滤前重金属含量×100%

2结果与讨论

2,1硫杆菌的分类鉴定

2.1.1嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(A.f)的分类鉴定：根据选择性培养条件，FeS04.7H20为唯一能源物质，不再加任何碳源，pH为2.0，仅能使嗜酸性的化能无机自养菌氧化亚铁硫杆菌生长。根据生理生化特征，菌体在代谢过程中利用Fe2+，产生黄铁矾沉淀。根据形态特征，菌体为杆状，约1.0um-2.0 um长，0.5um-l.0 um宽（图1）。根据16S rRNA序列比对，构建同源性系统发育树，结果显示，实验所获菌株NK-16与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(A.f)的菌株具有99%同源性（图2）。

2.1.2嗜酸性氧化硫硫杆菌(A．f）的分类鉴定：根据选择性培养条件，S为唯一能源物质，不再加任何碳源，pH为3.5-4.0，仅能供嗜酸性的化能无机自养菌氧化硫硫杆菌生长。根据生理生化特征，菌体在代谢过程中利用S，产生H2804，使pH降低。形态特征，菌体杆状，约1.0 um-2.0 um长，0.4 um-0.7um宽（图3）。根据16S rRNA序列比对，构建同源性系统发育树，结果显示，实验所获菌株NK-06与嗜酸性氧化硫硫杆菌(A.t）的菌株具有99%同源性（图4）。

2.2生物淋滤过程中pH变化

生物淋滤过程中，各试验组pH呈下降趋势，对照组pH呈上升趋势（图5）。淋滤结束后，A.f,A.t以及A.f和A.t混合菌淋滤分别使pH由初始值4.0降低至1.9、1.64和1.75;对照组的pH由初始值4.0上升至7.15。A.f使pH降低的原因是A.f将Fe2+转变为了Fe3+之后，Fe3+水解以及Fe3+生成黄铁矾沉淀的过程中产生H+：A.t使pH降低的原因为A.t将底物S氧化成H2804;A.f和A.t混合菌淋滤降低pH是由两种菌的共同作用引起。淋滤的前6天，A.f和A.t混合菌淋滤降低pH的速度最快，但从第7天开始，A.t淋滤降低pH的速度最快，淋滤结束后A.t淋滤使pH达到最低值。本研究中A.t在淋滤后期持续酸化污泥的能力与LC Chan报道的结论相类似。

2.3生物淋滤过程中ORP变化

生物淋滤过程中，试验组和对照组的ORP变化如图6所示。淋滤的第1天，试验组和对照组的ORP均呈显著上升。淋滤第2天至第9天，各试验组的ORP仍然随时间逐渐升高，而对照组的ORP在略微升高后开始下降，继而出现波动。ORP升高的原因主要是A.f引起的Fe2+的氧化和A.t引起S的氧化。在第9天淋滤结束时，A.f,A．f以及A.f和A.t混合菌淋滤分别使ORP由初始值228、191和212上升至612、605和611。而对照组的ORP仅从173上升至288。淋滤过程中，A.f和A.t混合菌淋滤的ORP略高于A.f和A.t各自单独淋滤。

2.4生物淋滤过程中各种重金属去除率变化

生物淋滤过程中，各种重金属去除率的变化如图7所示。由pH和ORP的变化可知，对照组的重金属去除率应远低于各试验组，所以在此对照的数据没有给出。

在淋滤过程中As，Cr和Ni的去除率随时间延长逐渐升高。在淋滤过程中，A.f和A.t混合菌淋滤的效果优于A.f或A.t单菌淋滤。As、Cr和Ni去除率的变化表明这三种金属的溶解与pH和ORP密切相关，随着pH降低和ORP升高，重金属的溶解率也逐渐升高。淋滤9d后，混合菌对As、Cr和Ni的去除率分别为96.09%、93.47%和97.88%;A.f单菌淋滤对As、Cr和Ni的去除率分别为94.51%、92.09%和92.83%;A.t单菌淋滤对As、Cr和Ni的去除率分别仅为68.29%、80.36%和93.51%。

Cu和Zn的去除率变化表明，A.f和A.t混合菌淋滤和A.f单菌淋滤在第3天时就溶解了90%以上的Cu和Zn;而A.t淋滤在第6天时才达到此效果。

A.f和A.t混合菌淋滤与A.f单菌淋滤在第3天时的pH分别是2.33和2.40;此时A.t单菌淋滤的pH是2.66。可见，Cu和Zn对2.50左右的pH非常敏感，在pH低于2.40时绝大部分被溶解。随后各试验组对Cu和Zn的溶解率稳定或缓慢上升。淋滤9d后，A.f和A.t混合菌淋滤对Cu和Zn的去除率最高，分别为98.32%和98.60%;A.f单菌淋滤对Cu和Zn的去除率分别为95.98%和96.49%。A.t单菌淋滤对Cu和Zn的去除率分别为95.87%和96.83%。

Cd和Pb在淋滤的前3天去除率迅速增加，第3天至第6天保持稳定或略有上升，但是在第6天以后，去除率反而下降。这可能是因为溶解的重金属又重新与污泥结合生成不溶状态。A.f和A.t混合菌淋滤对Cd和Pb的去除率最高值出现在第6天，分别为100%和94.71%，但是第9天时，含量已经分别下降至0和28.62%。A.f单菌淋滤对Cd和Pb的去除率最高值也出现在第6天，分别为100%和84.96%，但是第9天时，含量均下降至0。A.t淋滤对此两种金属的去除始终发挥重大作用，A.t淋滤在第3、6和9天时对Cd的去除率分别为97.27%、98.75%和86.62%;对Pb的去除率分别为97.56%、98.70%和91.37%。

综合以上各种重金属生物淋滤的结果，对于As、Cr、Cu、Ni和Zn，A.f和A.t混合菌淋滤的效果最好，并且延长淋滤时间可以提高这些金属的去除率。但是对于Cd和Pb，当淋滤时间超过6d时，混合菌淋滤对这两类重金属的去除率迅速下降，唯有A.t单菌淋滤可以保持较高的去除率。因此需要选择合适的淋滤时间和合适的菌种搭配，使各种金属的去除率达到最佳值。

3结论与展望

    生物淋滤过程中，pH逐渐降低，9d的生物淋滤使pH最终降低至2.0以下。ORP逐渐升高，9d的生物淋滤使ORP最终升高至600以上。对于As、Cr和Ni，重金属的去除率与pH和ORP相关，随着pH降低和ORP升高，重金属去除率逐渐升高。对于Cu和Zn，重金属的去除率与pH相关，当pH小于2.4时，绝大多数Cu和Zn溶解。以上几种重金属，A.f和A.t混合菌淋滤的效果最好，并且延长淋滤时间可以提高重金属的去除率。淋滤9d后A.f和A.t混合菌淋滤对此几种金属的去除率都达到了90%以上。对于Cd和Pb，当淋滤时间超过6d时，A.f和A.t混合菌淋滤和A.f淋滤对此两重金属的去除率迅速下降，唯有A.f淋滤可以保持较高的去除率。因此要进行淋滤反应时间的控制，防止溶出的Cd和Pb又重新转变成不溶状态。目前作者正在采用实时PCR、PCR-DGGE等技术对淋滤过程中A.f和A.t菌群的变化进行分析，以期选择淋滤初期A.f和，A.t最佳的浓度配比。

  王聪1李强1李保宾1孙村民1，2邓飞1，2王淑芳2宋存江1，2

(1．南开大学分子微生物及技术教育部重点实验室天津300071)(2．南开大学生物活性材料教育部重点实验室天津300071)

      微生物学通报2010.4