黄瓜栽培面积大，分布地域广，鲜食加工咸宜，是人们喜食的主要蔬菜之一，在蔬菜周年生产中占有重要地位。黄瓜育种从常规品种选育，有性杂交育种，诱变育种到杂种优势利用，使黄瓜品种的生产潜力不断提高。随着20世纪70年代后期生物技术的迅速发展，作物品种改良获得了前所未有的发展。

利用组织培养技术，植物细胞工程技术和转基因工程技术培育的许多农作物品种已经在生产中应用，为社会和经济的发展做出了重要贡献。现从组织培养、相关基因分子标记、遗传图谱构建、种质资源亲缘关系、品种纯度鉴定和基因工程等方面对黄瓜生物技术的应用研究做简要概述。

1  黄瓜组织培养

在黄瓜器官培养方面以黄瓜子叶为外植体的研究较多。Kim等认为子叶大小可能影响外植体内的内源激素水平，进而对不定芽的诱导产生影响，而且黑暗处理可显著降低黄瓜子叶节直接不定芽的诱导率。而Cui,'uk等认为黄瓜子叶节不定芽诱导率在黑暗和光照条件下基本相同，导致研究结果并不一致的原因可能与不同黄瓜品种的外植体对于光照条件的要求存在差异有关。侯爱菊等认为外植体类型、基因型及植物生长调节剂对再生频率均有显著影响，而子叶节是最佳的外植体类型；6-BA单独存在即可诱导产生丛生芽，O．5 mg／L最佳。贾金生等认为带柄子叶比下胚轴和不带柄子叶的再生率高，是比较理想的外植体材料；添加0．5 mg／L AgNO，可以促进不定芽发生，5—6 d苗龄的外植体分化再生频率较高；高频率不定芽诱导分化培养基为MS+IAA O．6 mg／L+6．BA 0．5 mg／L+AgN030．5 mg／L；不定芽伸长的培养基为MS+IAA1．0 mg／L+6一BA 1．0 mg／L+GA3 1．0 mg／L+Ag- NO，0．5 mg／L；高效生根诱导培养基为MS+IAA0．2 mg／L+NAA 0．1 mg／L。而李永辉等。认为下胚轴比子叶效果好，其最佳愈伤组织诱导与生长培养基为MS+NAA 0．4—0．5 mg／L+CPPU 0．05—0．20 rag／L；最佳芽诱导培养基为MS+CPPU 0．1 mg／L。

不同基因型、不同生长调节剂可能是导致不同外植体培养结果不一致的原因。赵宇瑛等认为在以“津春四号”幼龄子叶为外植体培养再生完整植株时，只需极低浓度的NAA即能诱导大量愈伤组织；在0．05—0．10 mg／L浓度范围内随NAA浓度的提高，出愈率提高，愈伤组织增殖加快；MS+6-BA1．O mg／L+NAA 0．10 mg／L为较适宜的愈伤组织诱导培养基；MS+6-BA 1．0 mg／L+IAA 0．05—0．10 mg／L为较适宜的芽诱导培养基；1／2 MS+NAA O．5 mg／L培养基对生根诱导效果较好。冯嘉碉等认为6-BA对“农城3号”黄瓜子叶节不定芽诱导起关键作用，IBA不利于黄瓜不定芽的诱导，且MS+6- BA 2．0 mg／L培养基是“农城3号”黄瓜通过子叶节进行不定芽诱导再生植株的最佳培养基。

在诱导离体子叶开花方面，周俊辉等认为在1／2 MS培养基中附加6．BA 0．10 mg／L能显著提高离体黄瓜子叶的开花率，White培养基中附加2．00 mg／L的KT下开花率也有明显提高，但植株矮小、瘦弱，整株变黄，甚至透明化，长势极差。同浓度的L．丙氨酸和L．酪氨酸均明显促进黄瓜子叶开花，且开花早；而甘氨酸对黄瓜子叶开花则有一定的抑制，开花率低。王首锋等认为用10 -5mol／L甲硫氨酸浸种处理显著促进离体子叶成花；离体子叶培养物的花芽分化力与子叶离体前的子叶／苗的鲜重比呈显著的正相关性。黄作喜等认为在MS培养基上培养离体黄瓜子叶时添加Spd和IAA对雌花诱导有显著协同作用，且适当提高昼夜温差、培养基中N素和pH值有利于黄瓜子叶的雌花诱导。

雷春等通过射线辐射花粉授粉并结合胚培养，从3个基因型中获得了单倍体植株。陈劲枫争研究了异源三倍体黄瓜的离体繁殖；在MS+2．2 mg／L 6一BA和MS+3．O mg／L KT+0．2 mg／L NAA培养基上诱导不定芽的增殖系数分别为6．53和6．63；丛生芽在MS+0．2 mg／L 6-BA的培养基上伸长，大约10 d后取整齐一致的芽用于生根，在1／2 Ms+0．2 mg／L IBA上生根率达91．7％。娄丽娜等以单性结实果实中的种胚进行胚培养时，发现果实生长时间、植株单性结实座果率对果实形成种子及诱导胚成苗均有影响，并且培养基中高浓度的6-BA对诱导胚产生单倍体植株具有较好的效果。

谢淼等认为黄瓜花药培养中小孢子最佳培养时期为单核中后期，取蕾标准为：花莆长度0．90—1．50 em，绿色，瓣尖未张开，花药白绿色或淡绿色。刁卫平等采用多种分化培养基对黄瓜未授粉子房培养形成的胚进行培养，获得稳定纯合的同源四倍体黄瓜材料。詹艳等以10个不同基因型黄瓜为试材进行游离小孢子培养，认为低温预处理有利于胚状体的诱导，4℃预处理2—4 d为宜，以处理2 d的胚状体产量最高。

2  黄瓜相关基因的分子标记

目前，在黄瓜上相关基因分子标记技术主要有：RAPD、AFLP、SRAP、SSR和SCAR。

黄瓜抗病性基因标记方面，Thomas等筛选出5个与黄瓜霜霉病基因(dm)紧密连锁的RAPD标记：G14-800、X15—1100、AS5-800、BC519-1100和BC526．1000，其中G14．800与BC519．1100标记距离最近，为9．9 cM。Park等对Prsv．2和zym两种抗性位点(分别抗PRSV．w和ZVMV)进行标记筛选，找到一个与zym共分离的AFLP标记E15／M47．F．197；另有3个AFLP与zym以5．2 cM连锁，而Prsv．2和zym相距2．2 cM。张桂华等以黄瓜抗白粉病母本Q9和感白粉病父本QlO及组合(津春3号)的F，分离群体为试材，采用BSA法用AFLP标记了抗白粉病相关基因。

黄瓜性别控制方面，陈劲枫等利用RAPD技术按BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行PCR扩增，检测出约1 000 bp全雌性的特征带。娄群峰等L22j筛选了与黄瓜全雌性位点连锁TG／CAC234，该标记与全雌性位点的连锁距离在6．7 cM，并将该标记成功转化为SCAR标记SAl66。陈惠明等以不同性别类型的黄瓜为研究材料将黄瓜雌性性状主控基因CsACSlG特异的SCAR标记定位在第10连锁群上。李效尊等L 24j用RAPD标记把侧枝基因(1b)定位在LG．2上，全雌基因(f)定位在LG．8上。潘俊松等利用SRAP标记将始花节位性状控制基因定位在第1X连锁群上。时秋香等采用SSR及SCAR分子标记技术，获得了3个与M基因紧密连锁的标记SSR23487、SCARl23和SSRl9914，它们与M基因的遗传距离分别为O．28、0．94和3．20 cM，两侧标记SSR23487和SCARl23将M基因定位在1．22 cM的遗传区间内。

另外，顾兴芳等运用AFLP技术，采用集群分析法(BSA)找到了与苦味基因连锁的两个显性AFLP标记：E23M66．101和E25M65—213。

2．1  遗传图谱的构建

遗传图谱的构建可为基因定位与克隆及基因组结构和功能的研究打下基础。Kennard等利用RFLP、RAPD、同工酶、形态和抗病性所产生的标记，构建了世界上首张黄瓜遗传图谱，包含58个位点，分属10个连锁群，覆盖的基因组总长度为766 cM，标记问平均距离为21 cM。张海英等[29 J利用黄瓜欧洲温室生态型栽培种140份重组自交系构建了由234个标记组成的黄瓜连锁图谱，其中包括141个AFLP标记、4个SSR标记和89个RAPD标记，覆盖基因组727．5 cM，平均图距3．1 cM。李效尊等利用F2代群体，构建了包括79个RAPD标记，分属9个连锁群，总长度1110．0 cM，平均间距为13．7 cM的黄瓜分子遗传框架图谱。Martin等构建了包含30个ISSR标记32个SRAP标记、分属7个连锁群、覆盖基因组长度992．2 cM，平均密度16．0 cM的遗传图谱。Nobuko Fukino等构建了包含120个SSR标记和6个SCAR标记，覆盖625．7 cM，包含8个连锁群的遗传图谱。Ren等构建了一张目前最为饱和高密度黄瓜SSR遗传图谱，包含7个连锁群、995个SSR标记、覆盖基因组573 cM、平均密度为0．6 cM，标记基本均匀分布，只有4个区域标记成簇分布。应用FISH分析已确定了各连锁群间和黄瓜染色体组的关系。

2．2  种质资源亲缘关系的研究

分子标记所控测的是基因组DNA水平的差异，可用于品种资源的鉴定与保存、研究作物起源与发展进化、亲缘关系等。李锡香等采用AFLP分子标记技术，通过聚类分析将70份种质分为三大组群，即西双版纳黄瓜(Cucumis sativus L var．xishuang— bannanesis Qi et'Yuan)组群，C．sativus var．hardwickii野生黄瓜组群和栽培黄瓜组群。西双版纳黄瓜与栽培黄瓜的距离最远，与野生黄瓜次之。按一定的遗传距离可以将中国和外来栽培种质分开。大多数华南型和华北型种质归属于不同的亚组。张桂华等对23份不同来源的黄瓜材料进行了AFLP分析，认为野生黄瓜和栽培黄瓜之间的亲缘关系较远，AFLP标记的分类结果与材料的主要性状特点基本一致。司曼星等利用18个SSR标记和3个SCAR共显性标记，把177份不同生态类型的黄瓜种质资源聚分为5大类，大部分旱黄瓜被划分在第1类中；多数的华南类型和加工型黄瓜被划分在第2类中；Concombre vert long和西双版纳本地山黄瓜被单独划为第3类；收集于韩国和美国的种质为第4类；大部分华北类型种质为第5类。欧洲温室型没有单独被划出来。王佳等利用ISSR技术对46份黄瓜材料分析，认为总体上来自于同一生态型的多数资源可以聚在不同的类或亚类中。穆生奇等利用SSR引物把59份黄瓜材料聚为7大类群：第1类包含6个欧洲温室型材料，全为无刺瘤类型；第2类是4个美国类型种质，属于小果型材料；西双版纳黄瓜D59单独聚为第3类；疑为华南型种质的D38，单独聚为第4类，其果实为乳白色；第5类包括D13及其父本D39，两者含有欧洲和华北血缘；第6类为叶色突变材料D28，是欧洲型和华北型黄瓜的后代；第7类包括33个华北型材料、7个华南型材料和4个日本型材料。庄飞云等采用RAPD方法，通过uP．GMA聚类分析，遗传距离0．37为阀值，把23份黄瓜材料归为黄瓜、近缘野生种、种间杂交种及甜瓜亚属种4类。陈劲枫等采用SSR和RAPD两种分子标记对黄瓜属22份进行聚类分析，结果分为两群：cS群(黄瓜、西南野黄瓜c．sativus var．hardwick．ii、C．hytivus及野黄瓜c．hystrix)和CM群(甜瓜、菜瓜C．melo var．conomon、野生小甜瓜C．melo ssp．agrestis及非洲角黄瓜C．metuliferus)。

2．3品种纯度鉴定

应用RAPD技术直接把种子的DNA作为检测对象，具有很高的准确性、稳定性和重复性。同时，该方法具有快速(数小时或数天)、简便、成本低、在苗期或种子阶段就可以鉴定品种纯度的特点。Matsuura等发现，利用RFLP分析可以快速检测黄瓜杂交一代品种的纯度。邓义才等用RAPD技术从40个随机引物中筛选出2个引物，准确、快速检测了“早春3号”黄瓜杂种的纯度。孙敏等从102个RAPD引物中筛选出应用于黄瓜种子纯度鉴定的引物32条，并建立了应用于鉴定亲本和杂交种子的RAPD指纹图谱。而Truska等在分析了3个黄瓜亲本材料的RAPD多态性后发现黄瓜多态性差，认为RPAD分析不适于验证黄瓜杂交种的纯度。分子标记技术还可以检测种子活力。黄瑶等采用RAPD技术分析了“揭阳大吊瓜”黄瓜种子经(58±

3黄瓜基因工程技术

自1983年首批转基因植物(烟草、马铃薯)问世以来，植物基因工程技术得到了迅速发展。利用这项技术，可以培育抗病毒、抗虫、抗除草剂、抗逆境(旱涝、盐碱、低温)作物品种，以及进行品质改良，增加作物可食部分的营养成分。

黄瓜基因克隆方面，Rasmussen等从黄瓜叶片中克隆了具有系统获得性抗性的过氧化物酶(a— cidic peroxidases)基因。李金鑫等克隆出了与黄瓜抗霜霉病相关的基因片段。杜栋良等L48j从新泰密刺黄瓜的幼叶中克隆得到长为1 018 bp的黄瓜磷脂酶D基因cDNA片段。刘春香等从黄瓜叶片组织中获得脂肪酸去饱和酶基因(Cs—FAD)。江彪等从黄瓜属野生种酸黄瓜(Cucumis hystrix Chakr)和栽培黄瓜(Cucumis sativus L．)中克隆了Tyl—copia类逆转座子逆转录酶序列。Chen等克隆了黄瓜ACC基因。Wang等k 52j克隆了黄瓜果实的脂加氧酶。同时笔者采用同源克隆法克隆到了黄瓜Vc合成关键基因GLDH(待发表)。

黄瓜转基因方面，Dennis等把CMV外壳蛋白基因转入黄瓜植株后病毒感染率为35％，而非转基因植株感染率为62％。Nishibayashi等通过导入CMV．0 cp基因，使黄瓜产生对CMV的抗性。Tabei等把水稻几丁质酶基因转入黄瓜中，从而提高了黄瓜对灰霉病的抗性。金红等获得了具有抗除草剂基因bar黄瓜转基因植株。

 黄瓜遗传转化其它方面，方丽等建立并优化了农杆菌介导转化黄瓜炭疽菌(Colletotrichum lage— narium)获得T-DNA插入突变体体系。张文珠等采用农杆菌介导法和花粉管通道法成功获得抗虫基因EQKAM黄瓜。李泠等以黄瓜子叶为外植体，以pEZT-ACSl为中间载体，利用优化的$52诱导分化培养基MS+BA 2．0 mg／L+ABA 2．0 mg／L+AgNO，2．0 mg／L进行农杆菌介导获得抗性再生苗。

另外，Lee L6~。等用农杆菌把木薯的CuZnSOD基因(mSODl)介导转化到黄瓜中，结果表明，mSOD!基因在果实中高度表达，而在叶片中表达水平较低，而且转基因黄瓜中SOD的活性是非转基因植株中的3倍。苏绍坤等将单性结实基因iaaM以农杆菌介导法导入到东农649品种黄瓜子叶节中，经过不定芽诱导和生根等过程获得了转基因株系。刘爱荣等L62j以黄瓜品种“中农15”子叶外植体为试料，绿色荧光蛋白GFP基因为报告基因，利用农杆菌介导的遗传转化法将构建的激活表达标签pDsBar导入黄瓜，获得转基因黄瓜群体。赖来等通过叶盘转化法，将从黄瓜中克隆到的MADS—box同源基因CSMADS06基因，转化到不同品系的黄瓜S06和$52中。王翠艳等将floral dip法用于黄瓜遗传转化并获得成功。

4讨论与展望

目前生物技术在黄瓜应用上取得了重大进展，但还存在一些问题。如黄瓜抗病性标记较少；黄瓜遗传图谱使用稳定的、重复性强的分子标记较少，而稳定性较差的RAPD标记较多；利用永久性作图群体、可通用共享的遗传图谱还较少；遗传图谱还需进一步整合；商业上应用转基因黄瓜品种还较少。由于黄瓜的遗传基础狭窄，还需利用生物技术创造黄瓜新种质，从而拓宽黄瓜遗传基础。可以预测，现代生物技术为黄瓜的遗传育种开辟了广阔、诱人的前景，它使常规手段在黄瓜品种改良中无法解决的问题得以解决，将加速黄瓜品种选育的进程。

韩建明  王颖(洛阳师范学院生命科学系，洛阳471022)

生物技术通报，2010年第8期