鸡作为广泛应用于科学研究中的模式动物，其胚胎对于基因功能的研究有着无法取代的优点。长期以来鸡胚是研究胚胎发育和器官形成机制的最好模型，并用于许多与发育和器官形成相关的候选基因在不同器官形成阶段的表达状况的研究，因此鸡胚胎的形态和发育模式已经被阐述得十分详细。另外，鸡胚可以在显微镜下被操作，随后的发育也可以在体外被监控和录像，这是其它物种的胚胎无法取代的。近年来表达绿色荧光蛋白的转基因鸡的研制成功，又为发育生物学中关于组织器官的形成和退化的研究提供了更好的条件。随着鸡的基因组序列的发表和随之发展起来在鸡卵中进行的对基因功能获得和缺失的研究技术，鸡胚模型更为广泛地应用于发育生物学、遗传学、细胞生物学和生物医学等各个领域，尤其在研究在胚胎早期发育中起重大作用的基因功能方面拥有巨大的潜力。

对基因进行功能获得和功能缺失的实验，观察这些变化对生物体内其它基因和代谢途径的影响是研究基因功能的主要手段。功能获得主要通过过量表达基因即转基因来实现。功能缺失可以通过转基因敲除或者是利用RNA干扰来实现。本文将介绍在鸡胚中进行基因功能获得和缺失研究的主要技术。

1在鸡胚中实现基因功能获得(过量或错误表达外源基因)的技术

1．1  电穿孔转化法

    电穿孔法是人为在组织中制造电场，使细胞膜结构发生变化而产生可逆的小孔使DNA得以通过，并且利用DNA分子自身携带的负电荷使DNA穿过细胞到达目的组织。电穿孔法应用于往细菌或细胞中导入外源DNA已有很长历史。对细菌和细胞系的电穿孔转化通常使用高电压，因此常常导致50％~70％的细胞死亡。为了克服这个障碍，对于胚胎的电穿孔转化通过使用固定的低电压来保证细胞的存活。以在鸡的神经管中表达外源基因为例，在鸡胚中实施电转化的基本操作方法如下：首先在蛋壳上开个小口，把DNA注射到神经管中。在Hamberger和Hamilton(HH)10体节期，神经褶闭合形成神经管，适合于DNA的注入。两电极贴着胚胎沿前后轴方向平行插入，两电极间的电压差导引DNA向神经管的一侧移动，从而使另一侧成为未被转化的空白对照。随后胚胎在卵中继续培养一段时间，让转入的基因得以表达。通常绿色荧光蛋白基因(-GFP)或B半乳糖苷酶基因(1acZ)会被用作报告基因用来检测转化的效率和范围。转入的基因表达可以用RNA原位杂交和免疫原位杂交的方法鉴定(见图1)。

如需要在不同的组织转入基因，只需将电极放置在不同的位置，或者改变电极的形状以适应器官的形状。另外在转入的DNA中可以添加组织特异性的增强子来促进基因在特定组织中的表达。

1．2逆转录病毒载体法

  逆转录病毒(retrovirus)和慢病毒(1entivirus)载体法也是用于实现转基因和基因功能获得的主要方法。此方法利用逆转录病毒正常的生命周期来感染动物。简单过程如下：将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体中，制成高滴度的病毒颗粒，用来感染胚胎。逆转录病毒RNA进入宿主细胞内，被反转录成DNA并整合到宿主细胞的基因组中，进行表达和遗传从而得到转基因动物(见图2)。

慢病毒属于逆转录病毒科的一个属，最典型的慢病毒是人免疫缺陷病毒I型(HIV I)。它除了具有逆转录病毒的gag．pol和env三个负责病毒的合成、复制和包装的基因结构外，还具有4个辅助基因vif、vpr、vpu和nef’以及2个调节基因tat和rev。慢病毒克服了逆转录病毒只能转染分裂细胞的缺点，也可以转染静止的细胞如神经细胞、肌肉细胞等。而且慢病毒具有宿主范围广、引起免疫反应小，整合到基因组的目的基因可以长期表达的特点，使得它成为当前被广泛运用的转基因载体(见图2)。

1．3  改良的电穿孔转化法和逆转录病毒载体介导的电穿孔转化法

    传统的电穿孔转化法将cDNA克隆在质粒表达载体里转化到鸡胚中，由于转入的外源DNA不能整合到鸡的基因组中，只能让基因在鸡胚中瞬时表达。而且外源DNA在细胞中的浓度会随着细胞的分裂而稀释，所以转入的基因会逐渐丢失。因此有研究者改良了电穿孔转化使用的载体，在其中加入了转座子结构，在转座酶存在的情况下，载体中的外源DNA可以通过转座子作用整合到细胞基因组中。

    逆转率病毒载体法虽然可以有效地将外源基因整合到基因组中，但不适合于对发育早期的胚胎进行转染。而且逆转录病毒载体可承载的外源基因DNA的容量有限，使其不适合于大片段基因的转基因。

逆转录病毒载体介导的电穿孔转化法是目前最高效、快速并持久的转基因方法。此法结合两种方法的优点，用电穿孔转化的方法将同时含有外源基因和逆转录病毒部分序列的质粒转入鸡胚中，从而克服了两种方法的缺点。如Hiraki Sakuta等所述，转基因的过程如下：首先要选择对反转录病毒易感的鸡种胚胎来进行试验；第二，将要表达的基因克隆到逆转录病毒载体中；第三，将受精鸡蛋在37．5℃孵育26~40 h直到达到HH 8～10期；70％酒精消毒鸡蛋外壳，用镊子在尖的一端开一个小口，吸出3-5 mL蛋清，用胶带封住小口后，用镊子在水平放置的蛋顶端开椭圆的小孔，观察胚胎发育情况。如果未达到HH 8-10期，可以封好小孔，继续孵育。第四，电转化(以电转化视网膜特异表达的基因为例)。将距离4 mm的两电极预湿后从椭圆孔放人鸡蛋，负极放在卵黄膜上，正极放在鸡胚的喙侧。将DNA注入神经褶(HH 8期)或视泡(HH 9~10期)(图3A，B)。注射后施加方波电压(2(卜24ms)3—5次，间隔400ms。电转化完成后，将小孔用胶带封好，放回温箱继续孵育至需要的时期。逆转录病毒载体中加入GFP报告基因可以帮助评估转基因的效率。试验结果表明，逆转录病毒载体介导的电转化法可以使转入的基因在转入6 h后开始表达并持续到16 d胚胎期以后，而使用传统的表达载体只能使基因表达持续2-3 d(见图3)。

2在鸡胚中实现基因功能缺失的技术

新的基因敲除技术利用基因类似物和小分子干扰RNA和电穿孔技术结合来达到令鸡胚中的基因在特定的时间和位置失去功能的目的。主要方法有3种：电穿孔法转化吗啉基反义寡聚核苷酸(morpholino antisense oligo)，显性负性结构(dom— inant-negative construct)和小分子干扰RNA(small interfering RNAs)。

2．1  吗啉基反义寡聚核苷酸

    吗啉基反义寡聚核苷酸是核苷酸的类似物，用吗啉基代替了脱氧核糖。吗啉反义寡聚核苷酸在许多脊椎动物模式动物中，是敲除蛋白功能的强有力工具。当吗啉反义寡聚核苷酸根据mRNA的临近反义起始位点序列设计时，它会和mRNA紧密结合，抑制翻译起始复合物的形成，从而阻碍蛋白质的翻译和合成。如果根据RNA前体中的外显子和内含子边界处序列设计吗啉反义寡聚核苷酸，得到的产物会干扰RNA剪接复合物的工作，从而产生多种剪接产物或导致对蛋白质的功能很关键的外显子被剪切掉，达到造成基因功能缺失的目的。使用电穿孔技术和吗啉基反义核苷酸相结合，在鸡胚中已经成功地，可重复性强地造成了基因失活。

由于吗啉基本身不带电荷，所以为了利用电穿孔法提高转化效率，一般要在对吗啉基反义寡聚核苷酸进行修饰使其带上电荷。

2．2显性负性结构

    显性负性结构表达被突变或是被剪切的蛋白质，称为正常蛋白质的竞争拮抗物从而干扰了正常蛋白的功能。它们可以用前面提到的过量表达的方式导人鸡胚中。

显性负性结构作用的原理是因为他们表达的蛋白保有正常蛋白的一些功能但不是全部，它们有和底物或目标蛋白结合的能力但是缺乏关键的功能。

2．3 RNA干扰

    RNA干扰(RNS-mediated interference)是用双链RNA((1SRNA)引起与其同源的基因的沉默。大于30碱基的dsRNA在高等动物中会引起非特异性的mRNA降解，使细胞的蛋白合成不能进行而导致细胞死亡。使用化学合成的21~22碱基对的小RNA(siRNA)或者可在细胞内通过RNAi机器变成小RNA的小核RNA(shRNA)就可以避免细胞毒性。

    用于瞬时表达小核RNA的载体主要携带有RNA聚合酶Ⅲ启动子(哺乳动物的U6或H1启动子)。在鸡中，用化学合成得到的小RNA和克隆在载体中的shRNA通过电穿孔的方法都成功造成了基因沉默。但因为siRNA的易于降解和U6启动子的不够强大，这些方法并没有得到广泛的应用。

    近年来，研究者将shRNA和基因组中存在的微小RNA(microRNA)序列结合起来(因此可以利用自然的siRNA合成系统)，并克隆到反转录病毒载体中，使用鸡的U6启动子，在鸡胚中取得了很好的基因敲除效果。目标基因被敲除的效率达到了90%。现存的问题是高效率的同时也带来了非特异性的基因敲除效应。所幸的是这个问题正在被出售RNAi产品的公司逐步解决。相信在不久的将来，高效持久的RNAi产品会被广泛运用在基因功能研究中。

刘  薇(美国得克萨斯州贝勒医学院)

中国家禽2009.12