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动物转基因技术
转基因技术是借助于基因工程技术将体外重组的结构基因导入受精卵或胚胎，培养出转基因动物的技术。它是人类按照自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的基因组成，基于现代分子生物学和动物胚胎和配子生物工程技术的一项试验技术。此项技术被公认为是遗传学研究中继本世纪初的连锁分析、60年代的体细胞遗传、70年代的基因克隆之后的第四代技术。自从1980年Cordon首次获得带有外源基因的转基因小鼠以来，人们已经成功获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙及多种转基因鱼。
转基因动物的基本原理
转基因动物系统是一种分子水平、细胞水平和活体动物水平的综合研究体系，它是遗传学、分子生物学、细胞生物学、生殖生物学、发育生物学、实验动物学等学科的理论和技术的综合应用。应用这个系统，能从分子水平人手，实现对动物基因的定向改变(突变)，然后在活体动物机体的不同层次(分子、细胞、组织、器官和系统)观察基因活动情况和表型效应。
转基因动物是指一类动物的基因组中整合有外源目的基因。通过转基：因技术，将改建后的目的基因或基因组片段导入实验动物的受精卵，使其与受精卵DNA发生整合。然后将此受精卵转移到雌性受体的输卵管或子宫中，使其顺利完成胚胎的发育。因此，后代的体细胞和性细胞的基因组内携带有目的基因，并能表达而呈现其生物效应。
外源基因可能只整合入动物的部分组织、细胞的基因组，称嵌合体动物；如果动物所有的细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，称转基因动物。整合入动物基因组的外源基因称转基因。人们可以通过分析基因和动物表现型，从而揭示外源基因的功能。
动物基因转移的研究方法
原核期胚胎的显微注射。
该方法由美国人Gordon发明，是目前应用比较广泛、效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。Gordon将SV40的复制原点和启动子与疱疹病毒的TK基因插入细菌质粒pBR322，然后将之注入受精小鼠的原核，并将经质粒注射后的胚胎植入假孕母鼠的输卵管。之后对出生的小鼠用Southern印迹杂交法检测其基因组中是否含有注射基因的同源片段。在出生的78只小鼠中，其中两只被认为是转基因阳性。由于条件的限制，Gordon当时并未得到活的转基因小鼠，但这一伟大的尝试确证了外源基因可以通过这种方法整合到宿主基因组中，从而为以后的研究工作开辟了一条崭新的途径。继Gordon报道了显微注射法产生转基因小鼠之后，Palmiter 1982年的报道在生命科学领域中引起了一场不小的轰动。Palmiter将5·
显微注射法的优点在于：(1)转移效率高，整合率可达30％；(2)可直接获得不含载体片段的DNA，避免原核载体片段的表达抑制作用；(3)不经嵌合体便有可能获得纯系；(4)基因导入的速度快。但其不足之处是：(1)操作复杂，设备昂贵不易推广；(2)导入外源基因的copy数无法控制，转基因为单复本或复本首尾串联成多联体；(3)外源基因随机整合到基因组中，常导致宿主DNA发生较大突变，有时可造成严重生理缺陷；(4)这种方法应用时期有限，完全不适用于发育中的后期胚胎细胞。
逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎
Jaenisch以鼠莫氏白血病毒感染附植前的小鼠胚胎(4～8细胞)得到整合外源基因小鼠，并用回交方法证明这种整合外源基因的小鼠其外源基因的遗传遵循孟德尔规律的报道较Gordon的报道早4年。当时的研究表明，宿主动物每一细胞整合外源基因的拷贝数为1，整合位点是两个可能的整合位点中的一个。之后，Salter等用禽白血病病毒感染早期的鸡胚胎制作了转基因鸡，Haskell等应用该方法制作了转基因牛。
通过病毒DNA插入宿主细胞DNA的机制，将外源目的基因整合到宿主基因组，呈单一位点、单拷贝结合，整合率高以及插入位点克隆分析比较容易等都是逆转录病毒感染法的优点。
精子载体法
早在1971年Bracket及其合作者就开始了精子介导外源DNA转移的先驱工作：将精子暴露于纯化的SV40 DNA(H3标记腺嘌呤)中后，在精子的头部检测到放射性物质。他们的结果表明异源NDA可以进入哺乳动物精子，而且精子能将外源DNA携入卵母细胞。18年后Lavitrano等将小鼠精子与环状或线性化的pSV2CAT质粒在等渗的缓冲液中孵育15min，之后用于小鼠卵子的体外受精，受精卯在2细胞时移入受体鼠的输卵管。在受体鼠产生的250只小鼠中有30％的个体为转基因阳性，转基因不仅可以遗传给后代，而且后代尾组织和肌肉组织CAT基因的表达水平十分可观。但随后很多实验室无法重复出Lavitrano的报道结果。
Rottman等对上述精子载体法进行了改进，其改进方法是将外源DNA在与精子共同孵育之前用脂质体包埋，脂质体与DNA相互作用形成脂质体-DNA复合体。这种复合体比较容易和精子细胞膜融合，从而进入细胞内部。这种改进以后的精子载体法在转基因鸡的制作上获得了满意的结果。对12日龄鸡胚用Southern印迹杂交法检测发现转基因阳性率为26％，最理想的一次阳性率高达92％。实验还显示外源DNA并未整合进宿主基因组，而是以附加体的形式存在于染色体之外。
影响DNA与精子结合的因素可能是获得成功的关键因素，通过高压电场使细胞膜通透性发生暂时性的可逆变化后，使DNA分子进入精子细胞，从而达到转基因的目的，目前也有一些报道。国内黄伟民等(2000)研究了这种方法在家兔精子基因转移中的应用，探索了电刺激的最佳条件。
利用精子作为基因转移的工具，在实践中存在许多问题，如Brinsrer等(1989)根据Lavitravo的实验方案，在产生的1300只小鼠中无一阳性，另有一些实验也无法重复此类实验。但此技术在构思上对于大动物转基因研究具有重要意义。
胚胎干细胞技术
胚胎干细胞(Es)是早期胚胎经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系，体外培养时保持末分化状态，可以传代增殖。Es细胞在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞，当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。Es细胞具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。在转基因领域，Es细胞是公认的研究基因转移、基因定位整合的一类极有前途的实验材料。
Robertson等用mos-neo反转录载体感染EK．CCE系小鼠干细胞，当确证反转录载体整合进干细胞基因组后，将每10—12个整合外源DNA的干细胞植入一枚小鼠囊胚期胚胎囊胚腔，在得到的21只小鼠中，20只小鼠体细胞及生殖细胞中含有外源载体的序列，部分嵌合体小鼠可将外源DNA传递给F1代。这同样是一起了不起的事件。用这种方法制作转基因小鼠的阳性率接近100％，经过耐心细致的选择，极有可能得到稳定遗传的动物新品系。。但遗憾是截止目前世界范围内只有小鼠干细胞的建系方法比较成熟，而大家畜干细胞研究还在探索阶段，Es细胞株不易建立，尽管获得类Es细胞，但该细胞能否被转入囊胚，是否参与嵌合体胚层形成，尚未见资料报道。这方面的研究一旦突破，将为转基因的大动物的定点整合开创新的领域。
原生殖细胞介导技术
原生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)介导的转基因技术在原理和方法上与Es细胞技术相似，应用PGCs技术在制作转基因家禽方面有明显的优势。Brinster等尝试了在公畜个体之间转移精原细胞的可行性，研究者将ZFlacZ系供体小鼠的PGCs植入C57BL／6×STL杂交一代小鼠的曲精细管，之后的研究结果表明经移植后的PGCs能够发育成具有受精能力的精子细胞，并产生了后代。Naito等应用此方法制作了转基因鸡。
大家畜PGCs可否象小鼠Es细胞那样抑制分化并增殖到目前还不能得出确切结论，如果能，这将为动物转基因带来一场革命。已有研究证实PGCs具有受精能力。这项技术结合基因定位整合技术极有可能在较短的时间内得到转基因家畜纯品系。
体细胞核移植的方法
随着动物克隆技术的不断发展，利用携带外源基因的培养细胞进行核移植的方法建立起来。Schnieke等用阳离子脂质体介导外源基因转染到培养的绵羊胎儿成纤维细胞中，然后将细胞融入去核卵母细胞中，经激活后在体外培养至囊胚移人同步受体母羊中，最后获得6只转基因绵羊。Cibelli等用同一方法获得了3只转基因牛．毫无疑问，该方法产生个体的外源基因整合率为100％，但是核移植技术难度较大，成功率较低，且胎儿成活率不高。
电转移法
将受精卵与外源DNA按一定比例混合后，放入一电脉冲槽中，经一定强度的脉冲电压刺激，外源DNA即可进入受精卵。这一方法操作简便，是处理批量较大的基因转移的方法。然而这一方法在哺乳动物中至今未见报道。
染色体片段显微注射法
从人或动物染色体上割取特定的染色体片段(M期)注入动物早期胚胎中，以获得DNA的动物，严格地讲称为转染色体动物(Transomics)。经过目前该技术应用困难较大，且成功率很低(0-0．002％)；但由于它具有不需经基因重组就可转移超大型’DNA(大于1000Kb)之独特优点，适于多基因转移。鉴于本法导入的遗传信息片段长，能生产出具备某些特殊疾病的实验动物模型。
其它方法
除此以外研究者根据其特定的研究内容和目的，选择其它合适的基因转移方法，如磷酸钙沉淀法；DEAE-葡萄糖介导法；基因打靶法(微弹轰入法)。
1999年7月21日，英国PPL医疗公司宣布他们用一种新的技术获得了两只定点整合的转基因羊Cupid和Diana，他们已经将这一技术用于一些人类蛋白的开发。PPL已经申请了该技术的专利，这一基因打靶技术主要包括两个步骤，首先是将外源基因插入培养的动物体细胞染色体的特定位点，然后筛选出阳性克隆的细胞进行核移植。但具体的技术环节没有公布。
转基因技术经过十几年的发展已取得了巨大的进步，特别是l近一年来在提高整合率及定点整合上都取得了突破性的进展，随着该技术被更广泛地应用，如何降低转基因技术的难度，使之更
易于操作，提高转基因技术的成功率也将是研究人员需要考虑解决的问题。
转基因动物的应用
在过去十年中，转基因动物系统在生命科学中得到广泛应用，除对基础动物学研究应用外，在医学研究、基因治疗、生物药业中的应用以及动物、植物品种改良均有其应用价值。
转基因动物与医学科学研究
当今，医学科学研究已发展到从分子水平认识人体的结构、生理和疾病的阶段。
(1)作为人类疾病的转基因动物模型
完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，并可为测试各种可能的治疗提供一个统一有效的方案。由于鼠的基因操作已经有了一套较成熟的方法，并且具有饲养成本低，繁殖周期短，产仔数量多等其它哺乳动物不可比拟的优点。虽然鼠类与人类的亲缘关系距离甚远，所提供的信息有时对人类疾病的治疗帮助不大，但它能帮助人们深入了解复杂疾病的病因和发展过程。人为地定向改变小鼠基因组中的某个特定基因，也可以人为地加入一个或多个外源基因，因此，在制备遗传病动物模型上显示出很好的应用前景。目前，已建立了30多种人类遗传病的鼠模型，如老年性痴呆症、原发性高血压、糖尿病、镰刀型细胞贫血症和肾功能衰竭等。通过微注射法将一些病毒的基因组DNA导入小鼠基因组，这些小鼠品系可以作为感染性疾病的动物模型。
(2)转基因技术在生物药业中的应用
当前研制成功的转基因药物已有不少，有的已通过审定进入
临床试用。从理论上讲，转基因技术生产的多种人血蛋白都是人类疾病大量需要的人血蛋白，如血友病患者所缺少的，尤其是人凝血因子；先天性缺乏c蛋白的人等。1998年2月，国内报道，上海医药遗传研究所与复旦大学遗传研究所多年合作“转基因羊”研究，已培育出有人凝血因子(抗血友病因子β)基因结合的转基因羊。1999年3月，相同单位继去年成功培育出转基因羊之后，又获得携带有人血清白蛋白基因的转基因试管公牛，与转基因羊相比，具有更高的经济价值。
转基因技术在动物品种改良中的应用
基因转移技术虽然在牛、羊、猪、禽等动物上应用结果尚不理想，但随着对结构基因和调节基因研究的深入，结合大量筛选工作，最终应该可以通过基因转移技术培育出理想的动物新品系。
(1)转基因牛
牛的繁殖周期很长，一般世代间隔为2年，正常情况下每胎只产一头犊牛，从活体中获得大量用于制备转基因动物的受精卯是很困难的。哺乳动物的乳腺作为生物反应器，乳牛当然成为转基因的首选动物。研究转基因奶牛的目的在于获得产奶量更大，生长更快以及改变了牛奶成分的优秀品种。
应用微注射法将外源基因导入牛体的主要步骤是：从屠宰场收集奶牛的卵母细胞，并使之在体外成熟。用公牛精液对成熟卵母细胞进行体外受精。分离受精卵，将外源DNA通过微注射法导入受精卯的精原核内。胚胎体外培育到囊胚阶段，将其移植于同步发情的处于囊胚发育阶段的母牛输卵管漏斗部，从而获得效率不高的转基因犊牛。对转基因子代进行筛选。
(2)转基因羊羊属多胎动物，一般每胎产1只一2只羔羊，最好的产3只～5只羊羔。转基因羊大多集中于利用其乳腺作为生物反应器生产药用蛋白，虽然产奶量比奶牛低，但转基因羊比转基因牛容易获得。
用羊乳球蛋白启动子驱动抗
胰蛋白酶基因，构成转入基因，然后通过微注射法将DNA导入绵羊的成熟卵细胞。将杂合体羊羔经过进一步交配获得纯合转基因羊，用多聚酶链式反应(PCR)检测转基因后代。抗胰蛋白酶只在乳腺组织中表达，收集含有抗胰蛋白酶的转基因羊奶，分离出其中的蛋白质。将得到的纯抗胰蛋白酶用于治疗遗传性抗胰蛋白酶缺乏症。
(3)转基因猪
实验证明，导入人生长激素基因猪的生长速度和出肉率都比普通猪高一倍，但是，这一正效应却被患胃肠炎、易染肺炎、心衰、关节肿胀等负效应所抵销，人类食用后是否有损健康，迄今全然不知。晚近报道，以转基因猪的心脏用于人的器官移植，可减少人排斥。
(4)转基因禽类
禽类胚胎发育与哺乳动物比较有很大差别，它是多精受精，胚胎发生大部分是在体外进行，只有受精、卵裂、囊胚等阶段是在输卵管和子宫内发育。蛋生出时，胚胎已处于原肠早期，常规的微注射法不适用。禽类染色体多，如鸡有染色体39对，1～5为大型，6—10在光镜下可鉴别，11～39在光镜下为难以区别的微小染色体，这对基因定位工作增加了困难。转基因鸡一直是用反转录病毒载体法，此法虽简单而有特异性，但也存在潜在的不利后果，如会产生侵袭性病毒颗粒，往往有致癌作用。鸡和鹌鹑是人的食用动物，用此法转移基因，是存在安全性问题的。因此，在转基因鸡研究时，着重在于探索新的转基因法。
有科学家设想转基因禽类的过程大致如下：从供体胚中分离出囊胚层细胞，利用脂质体与外源基因DNA的复合体进行转染，将外源基因导入新孵鸡卵胚胎的胚盘下腔内，这样，子代中就含有混合细胞，即含有供体细胞遗传性的嵌合体。在一些嵌合体中，由转染细胞传代产生的细胞有可能发育成为部分生殖系统组织，并形成生殖细胞。通过对这些嵌合体进行连续杂交，建立起转基因鸡系。虽然此法进行基因转化的效率较低，但还是可以得到转基因鸡。
动物克隆技术
克隆(Cloning)的概念
“克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。
在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。
在细胞水平，克隆是指由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。比如，使一个单一细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由同一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。
在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆，因为他们来自同一个受精卵细胞，所以遗传背景完全一样。通过细胞核移植所得到的一个遗传背景完全相同的动物或植物群体也是一个克隆。但是，按此定义，“多莉”并不能说成是一个克隆，因为“多莉”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵母细胞中‘，得到两个以上遗传背景完全相同的“多莉”时，才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多莉”说成是一个克隆。
另外，克隆也可做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。
动物克隆的研究筒史
1952年Briggs等将青蛙囊胚期的细胞核移入去核卵中，经正常卵裂发育成蝌蚪，这是首次进行的细胞核移植试验获得成功，由此开辟了高等动物发育生物学研究的新领域1962年Gurdon以已分化的蝌蚪肠上皮细胞移植至去核蛙卵，结果产生了具有生殖能力的蛙，证明蝌蚪的体细胞仍具全能性。
1981年Illmensee和Hoppe首次发表了哺乳动物细胞核移植获得后代的论文，将小鼠囊胚内细胞团的细胞核移人去核受精卵，经体外培养可发育至囊胚期，将16枚核移植胚移入受体母鼠子宫，经正常妊娠产下3只小鼠再将其中一雌一雄小鼠进行自然交配，生下了数只具核供体表型的后代，证明克隆动物具有正常的生殖能力。但是，McGrath和Solter(1984)将小鼠8细胞胚和囊胚内细胞团的细胞核移入去核受精卵未获正常发育，Robl等(1986)将小鼠8细胞胚的细胞核移入去核的2细胞胚胎中，有51％重组胚发育至囊胚期，移入小鼠受体可附植(Implantation)，但妊娠不超过12天胎儿死亡。上述两篇文献似乎对Illmemee等的研究结果提出了疑问。
Tsunoda等(1987)将4和8细胞胚的细胞核移入去核2细胞胚，其重组胚不仅可发育至囊胚，而且移入受体小鼠后产生了克隆鼠。此结果表明细胞质因素的重要性。同时作者还指出，供体细胞核在移植前于低温(4℃)保存4小时～10小时，可能有助于供体核与受体细胞质的同期化，利于胚胎的重组和发育。WiUadsen(1986)将8和16细胞期绵羊胚胎的卵裂球与去核卵母细胞融合，移人中间受体母羊结扎的输卵管中作体内培养，4天半至5天半回收，可见其中一些重组胚已发育成囊胚，再移植至发情6或7天的受体母羊结果移植8细胞胚的卵裂球者生下了3只羊羔，移植16细胞胚的卯裂球者于妊娠60天时屠宰受体母羊获3只正常胎儿。此实验表明16细胞期绵羊胚胎的卵裂球仍维持全能性。
Robl等(1987)进行原核交换的核移植试验获得2头牛犊，但当以2-4或8细胞胚胎的核移入去核原核胚时均未见发育。Prather等(1987)将2至32细胞期牛胚胎的卯裂球移入去核卵母细胞，经电融合后作体外和体内培养体内培养发育至囊胚的19枚重组胚移植至发情68天的13头受体母牛，结果7头妊娠，其中两头受体各产一犊。Stice和Keefer(1993)进行了牛的多代克隆研究将16至64细胞期胚胎的卵裂球移入去核卵母细胞，连续克隆了四代，分别得到11、16、20和7枚胚胎，即从一个亲本胚胎共计克隆出54枚可移植胚胎其中部分移入母牛受体，获第一和三代的牛犊各一头。Stice和Robl(1988)以8细胞期兔胚卵裂球移植至去核卵母细胞，电融合和激活后检测激活率，尔后移入受体母兔输卵管，产下6只克隆仔兔。Prather等(1989)采用原核交换的方法进行核移植试验，获7头仔猪；用4细胞胚的核移入去核卵母细胞获1头仔猪。Campbell等(1996)采集9日龄的绵羊胚胎进行传代培养，建立细胞系以血清浓度递减的饥饿(starvafion)培养诱导6-13代细胞进入静止期(Quiescence)，继尔作为核供体移入去核的卵母细胞，体内培养发育至桑椹胚和囊胚时移植至母羊受体，产下了第6代(1只)、11代(3只)和13代(1只)全能性细胞核移植的克隆羊。这是首次用已分化细胞系经诱导进入GO期核移植产下的首例克隆羊。Wilmut等(1997)进而采用9日龄胚胎细胞系，26日龄胎儿成纤维细胞和一头6岁母羊怀孕3个月时的乳腺细胞进行核移植供体核依次分别取自第7-9代4-6代和3-6代的细胞，在血清浓度从10％降至0．5％的培养液中培养5天诱导至静止期尔后移入去核卵母细胞，经激活和融合后作体内培养，6天后发育为桑椹胚和囊胚，将其移植至受体母羊，结果胚胎细胞系为核供体者产羔4头，胎儿成纤维细胞者产羔3头，乳腺细胞者产羔1头，即为著名的多莉(Douy)，这是世界上首次用体细胞克隆获得的后代，是生物科学中的重大突破，证明绵羊乳腺细胞仍具有发展成新个体的全能性。(未完待续)
余华1 叶健强2 刘丹2
(1．四川出入境检验检疫局，四川成都610041，四川农业大学，四川雅安625014；
2．四川省畜牧科学研究院，四川成都，610066；
3．绵阳高新区管委会国家生物医药专业孵化器管理办公室，四川绵阳62100)
中国动物保健，2009.1总第119期