转基因动物(transgenic animal)是在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和DNA重组技术的基础上，通过实验方法人为地将人们所需要的目的外源基因导人某种动物的受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，随细胞的分裂而增殖，且能稳定地遗传给后代的一类动物。其实质就是按人们的需要有计划、有目的地定向改造动物的遗传组成，赋予转基因动物新的特征，使之更好地为人类服务。

1转基因动物的培育方法

    1976年，Jaenisch利用反转录病毒感染胚胎的方法进行转基因，这是最早的动物转基因方法。1980年, Gordon首次利用原核注射的方法开展动物转基因研究。随着基因重组技术的发展，科学家已经掌握了分离单一基因并利用基因剪切和拼接酶的作用修饰核苷酸结构,复制和分离人类所需外源基因，并转移到各种动植物基因组中。

    原核期胚胎的DNA显微注射(microiniection)：该方法由美国人Gordon发明，其基本原理是通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵，利用受精卵繁殖中DNA的复制过程，将外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。

    精子载体法(sperm mediated gene transfer)：Bracket等在1971年开始了精子介导外源DNA转移的研究．他们以精子作为载体，通过受精将外源DNA携入卵母细胞从而获得转基因动物，并可得到转基因系。后来，Rottman等对精子载体法进行了改进，将外源DNA与精子共同孵育之前用脂质体包埋，脂质体与DNA相互作用形成脂质体DNA复合体，这种复合体比较容易和精子细胞膜融合．从而进入细胞内部，这种改进以后的精子载体法在转基因鸡的制作上获得了满意的结果。

    精子头与外源基因合并注射卵母细胞：胚胎学家Anthony等的报道显示，通过精子头与待转移的基因片段一起显微注入MⅡ期的小鼠卵母细胞，在出生的后代小鼠中转基因阳性率可达20％以上。

    逆转录病毒载体感染(retrovirus-mediated gene transfer)：利用逆转录病毒在感染寄主时可以将病毒的一部分DNA整合到宿主细胞的特点，可以将体外构建的基因重组到病毒载体上，再用带有目的基因的病毒感染动物细胞，以达到将病毒携带的目的基因转入动物细胞的目的。

胚胎干细胞技术(embryonic stem cells，ES)：ES细胞在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞，当被注入囊胚腔后．可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成．因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移，产生转基因动物。

2转基因动物的研究现状

转基因动物研究的重点包括：开展培育具有优良性状、提高抗病力的家畜育种、建立“生物反应器”和疾病模型进行药物筛选等方面。

2．1转基因鼠：Palmiter将大鼠生长激素基因与金属硫蛋白基因启动子拼接成融合基因，导入小鼠受精卵后，获得了称为“硕鼠(supermollse)”的转基因小鼠，这是外源基因首次在动物体内得到表达，被认为是世界上首批转基因动物。1987年，美国的Gordon等人首次报道在小鼠的乳腺组织中表达了人的tPA基因。英国人将克隆羊的B一球蛋白(BLG)基因转导人小鼠的受精卵，得到了携带有BLG基因的转基因小鼠，从而改良了乳汁品质．提高了乳汁营养价值，获得了可稳定遗传的新性状。

2．2转基因猪：为解决猪——人异种移植的超强免疫排斥反应，以缓解人体器官短缺的困难，英国科学家首次采用人的基因注入猪胚胎中，育出了带有人类基因小猪的这一创新性研究。我国科学工作者成功培育出了首例绿色荧光的转基因猪，也是世界上第4例通过体细胞核移植技术培育的该类转基因猪，阳光下看，它们的鼻子、舌头和蹄子呈黄色，但在紫外灯照射下则泛出绿色的荧光。

2．3转基因鱼：加拿大、美国和新加坡组成的科学研究小组找到了一种极度活跃的生长素基因，将其导入太平洋鲑鱼的卵中．培育出了比正常鲑鱼大37倍的巨型鲑鱼。之后不久．世界上先后研制出转基因虹鳟、沟鲶、鲑鱼、斑马鱼、罗非鱼、白斑狗鱼、非洲鲶鱼、太鳞大麻哈鱼、大麻哈鱼、银大麻哈鱼等，转移的基因主要有生长激素(GH）基因、抗冻蛋白(AFP)基因和某些作为标记用的报告基因。

2．4转基因牛：20世纪80年代末，美国科学工作者采用转基因的方法育成了世界第l头带有人雌性激素基因的转基因牛。该牛能产出不饱和脂肪含量少并适于喂养婴儿的牛奶。在以后的几年中，又培育出了2头能产出胰岛素生长因子的新类型牛。2003年，李宁教授的研究小组培育出了中国首批转基因体细胞克隆牛，标志着我国转基因体细胞克隆牛的生产技术体系已经成熟。

2．5转基因禽类：生产转基因鸡可以改进现有品种的遗传特性，例如增加抗病性、提高生产性能、降低鸡蛋中的脂肪含量和胆固醇水平等。目前，已经获得了转入禽类白血病病毒(avianleukosis viruses，ALV)的外壳蛋白基因env的转基因鸡，实验证明，获得的转基因鸡对禽类白血病病毒具有一定的抗性。英国罗斯林研究所通过改造母鸡的基因，培育出一种能产抗癌蛋的转基因鸡。

除此之外，1985年，美国人用转移GH基因、GRF基因和IGFl基因的方法，生产出转基因兔、转基因羊和转基因猪。2000年10月2日，首只转基因猴“安迪”在美国诞生．这是世界上首次培育成功的转基因灵长类动物。

3转基因动物的应用

转基因动物技术能在个体水平从时间、空间角度同时观察基因表达功能和表型效应，有效地将基因水平、蛋白水平与临床、生产水平的研究有机地统一起来，显示了良好的应用前景。目前，关于转基因动物在动物育种、制造生物反应器、改善畜产品的营养结构、建立人类疾病模型、器官移植等领域的研究越来越广泛。

3．1转基因动物在生物制药中的应用：20世纪70年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了高产值、高效率的基因药物，它的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展。转基因动物技术日趋成熟．在医药学领域中，既可作为基因药物的“生物反应器”应用，也可作为疾病动物模型用于疾病发生机制及药物筛选等的研究。

    转基因动物制药是转基因动物的一个非常重要的用途．它能生产出具有医药价值的生物活性蛋白质药物．一般是通过血液、膀胱、蚕茧、鸡蛋蛋清和乳腺的途径来获得。1992年，Swanson等制备了血液中含有人血红蛋白的转基因猪，这为从人以外的动物体获取珍贵的人血有效成分提供了一条新途径。1998年，Kerr等获得能在尿液中表达人类生长激素(GH)的转基因小鼠，含量高达0．5g/L。2003年，Tomita等将原骨胶原蛋白Ⅲ基因转入蚕体内获得成功，表明了某些昆虫的茧可以作为生产外源蛋白的良好生物反应器。2002年，Harvey等将B一内酰氨酶基因转入母鸡中，获得了蛋清中含有约3．5 g外源蛋白的鸡蛋。1987年，Gorden等就建立了第l例乳腺生物反应器小鼠模型，成功地表达了人组织纤维酶原激活剂(tPA)，对于溶解血栓有着显著的疗效。

    Wilmut等用整合了人凝血因子Ⅸ和新霉素抗性基因的胎儿成纤维细胞作核供体．通过体细胞核移植克隆出世界上第1头带有人类基因并能在乳汁中大量表达人类凝血因子Ⅸ的转基因绵羊“波莉”(Polly)”。Cibelli等也把胎儿成纤维细胞作供体，经核移植制作了3头含有外源标记基因(B一半乳糖苷酶基因)的犊牛”。

利用高效表达的克隆转基因动物生产珍贵医用蛋白是各国一直研究的重点，将医学上非常珍贵的蛋白质(如抗凝血酶Ⅲ、人血清白蛋白、B一干扰素、降钙素、胰岛素、人生长激素等)的基因通过基因打靶技术，定点转入牛或羊的乳球蛋白质基因中．在乳腺中高效表达，便可自乳汁中回收该蛋白质。目前已从转基因的动物乳汁中生产出的治疗蛋白主要有：奶山羊乳汁中高度表达的抗凝血酶Ⅲ和Or--1一蛋白酶抑制因子，绵羊乳汁中表达的OL--1一抗胰蛋白酶和人凝血因子Ⅸ，牛乳中表达的a-乳蛋白和乳铁蛋白,兔乳中表达的a-葡萄糖苷酶等。

3．2转基因动物在疾病研究中的应用：①建立诊断和治疗人类疾病的动物模型。人类的许多疾病都与遗传因素相关．利用转基因技术制造出各种遗传病的动物模型，可以方便地分析检测m遗传病的致病基因、发病机理，从而更好地防治人类遗传病。②生产可用于人体器官移植的动物器官。异源器官移植可能是解决世界范围内普遍存在的器官短缺的有效途径。利用转基因技术改造异种来源器官的遗传性状，使之能适用于人体器官或组织的移植，是解决移植短缺的最有效途径。Lai等结合基因打靶和体细胞核移植技术，采用敲除a-1，3半乳糖转移酶基因的胎儿成纤维细胞作核供体，成功地获得了a-1，3半乳糖转移酶基因敲除猪，从而消除了猪作为人类器官供体的一个主要障碍，进一步推动了器官移植的发展与应用。③进行异种细胞移植。已知很多疑难疾病、生理功能紊乱都与细胞凋亡或细胞功能异常有关，但到目前为止，人类细胞还不能很好地传代培养，因此将异种细胞尤其是猪的细胞移植到合适的位点，将使人类实现细胞治疗成为可能。1994年，Groth等将猪的胰岛细胞移植给糖尿病病人，取得了一定的成效。1997年,Deacon等将猪胎儿神经细胞移植到患有帕金森疾病的病人大脑中，研究发现移植后的细胞能长久保持活力。

3．3转基因动物在动物育种中的应用：在畜牧业方面，可以在实验条件下进行转基因整合、预检和性别预选，并采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移。通过转基因克隆技术大量快速地繁殖出具有高产优质性状的转基因动物．以有利于降低生产成本，提高经济效益。

    转基因技术用于育种，不仅可以加快改良遗传性状的进程，使选择的效率提高，改良的机会更多，而且不会受到有性繁殖的局限。继Palmiter将大鼠的GH基因导入小鼠基因组得到巨型小鼠之后．牛、绵羊及人的GH基因也先后导入小鼠基因组．得到的转基因小鼠在快速生长期生长速度达到对照组小鼠的4倍。人类在转bGH基因猪方面的研究表明，转基因猪日增重增加，饲料转化率提高。Powell等将毛角蛋白Ⅱ型中问细丝基因导入绵羊基因组．转基因羊毛光泽亮丽，羊毛中羊毛脂的含量得到明显的提高。

许多科学家在研究疯牛病的病因时，采用转基因老鼠进行PrP基因结构分析．并利用转基因鼠研制出了抗PrP的单克隆抗体，通过临床试验已取得了有效成果,使人类对疯牛病在分子水平上有了科学评价和诊断依据,对疯牛病的病因有了明确的定位,只要提取其他动物抗PrP基因获得转基因牛，将会更好地防止疯牛病的发生㈣。

4转基因动物技术的不足

    转基因动物研究是人类按着自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，是基于现代分子生物学和动物胚胎和配子生物工程的一项富有挑战性的实验技术。它的研究成果在提高生产能力、改善畜产品质量、生产生物医药产品、研究人类疾病模型，特别是在治疗人类的疑难病症方面都显示出了广阔的应用前景。然而，转基因动物在研究过程中也存在着一些迫切需要解决的问题：

    首先，转基因技术支撑体系不够完善，主要表现为目前转基因动物的外源基因成功率和成活率极低，这是限制转基因动物发展的主要因素。目前，小鼠成活率仅为2．6％，大鼠4．4％，兔1．5％，羊0．9％，猪0．7％，牛0．7％。

    其次，体细胞克隆等技术环节还有待于成熟，并且有些技术会对动物健康产生危害，这就需要研究者在转基因技术的基础理论研究方面进行更为深入的探索。

    第三，外源基因在目的基因中的整合率低，效果不稳定。

    第四，转基因在宿主基因组中的行为难以控制，在宿主基因组中的插入可能造成内源基因的破坏,还可能激活原本已关闭的基因，使其进行表达，导致动物出现异常。

    第五．对转基因过程中的精细理论及其过程不甚清楚。例如整合的拷贝数、整合的机理、宿主染色体之间的相互作用，以及相同的基因表达调控元件在不同种系的差异与其宿主的遗传背景、外源基因的结构及其各种调控因子结合位点之间的关系等，都不是很清楚。

第六．尽管转基因动物给人类带来巨大的益处，但也存在一些安全性问题。如外源基因的插入可能造成基因污染，对生态平衡以及物种的多样性产生不良影响；转基因移植可能加大人畜共患病的传播机会，给人类带来灾难性的危害等等。

5转基因动物技术的展望

    转基因动物研究在其问世后的20多年里，经过世界各国科学家们的不懈努力，已经取得了辉煌的成就并不断得到完善。纵观目前的发展，转基因动物带来的不仅仅是一种全新的药物生产模式，极大地降低生物药品的成本和投资风险，而且还为人类社会带来了新的经济增长点。据美国红十字会和遗传学会预测：到2010年．动物乳腺反应器生产的药物将占所有基因工程药物的95％，具有巨大的市场价值，将会成为具有高额利润的新型产业。

    作为一个新生的产业，在转基因动物的发展过程中可能存在着一定的问题，需要科学工作者的不断探讨，但无可否认，转基因动物正以它特有的、潜在的优势蓬勃发展，相信随着理论和技术的不断完善，转基因动物及其相关的产品必将进入真正的产业化和市场化阶段，为人类的生产和发展起着推动性的作用。

潘伟荣，霍金龙，查星琴，张清政，牛自兵，曾养志(云南农业大学动物科学技术学院)

畜牧与饲料科学2008年第6期总第129期