单克隆抗体技术(monoclonal antibody tech- nology)，又称淋巴细胞杂交瘤技术，该技术的基本原理是应用PEG等融合剂将骨髓瘤细胞和经某种抗原诱导产生的特异性B淋巴细胞在体外进行细胞融合（亦可经电融合或激光融合），产生能连续传代、稳定分泌特异抗体的杂交瘤细胞(hybridoma)。这种杂交瘤细胞具有2种亲本细胞的特性，既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点。用建立的检测方法筛选阳性细胞融合孔，经克隆筛选出单个细胞克隆，再将其扩增，分泌的抗体即为单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)。与多克隆抗体(polyclonal anti- body，PcAb)相比，单克隆抗体为单--B淋巴细胞克隆产生的一种均一的免疫球蛋白分子，针对单一抗原决定簇，具有高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性好、效价高、成本低，便于人为处理和质量控制，并可大量生产等优点。

自1975年单克隆抗体技术创立以来，其日臻成熟，无论是抗原制备、免疫方法，还是从融合的过程直至单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，都已积累了十分丰富的经验。国内外已有许多实验室研制出各种各样的杂交瘤细胞株，由此产生的单克隆抗体被广泛应用于农业、医学及其他生物领域，并发挥越来越重要的作用。

1  检测微生物

单克隆抗体具有高灵敏性和高特异性，在鉴定菌种和病毒等的群特异性、种特异性、型和亚型特异性，乃至株特异性方面独具优势，且能鉴定寄生虫不同生活周期的抗原性，常用于疫病检疫、诊断、免疫监测和流行病学调查等。

1.1检测特异的病毒  植物病毒单克隆抗体的研制主要应用于植物病毒和病害检测及株系鉴别。目前，对植物病毒的诊断分析中应用最广泛的是马铃薯病毒（A1 Moudallal等，1985），主要包括卷叶病毒和A、M、S、X及Y病毒的检测鉴定。在动物病毒单克隆抗体的研制方面，刘建文等(2006)分别用原核表达的猪瘟病毒(CSFV)主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠，制备单克隆抗体，建立起CSFV抗原捕捉ELISA (AC ELISA)方法，用该方法检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品，与病毒分离和RT- PCR方法符合率分别为86.2%和90. 3%，表明该方法敏感、特异、重复性好。汪招雄等(2006)以猪伪狂犬病病毒(PRV) Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，以纯化的抗PRV IgG为检测抗体，建立了敏感性高、特异性强和重复性好的检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA方法，可广泛应用于动物组织中PRV的检测，也可检测同一病毒的不同毒株。

1.2鉴定细菌种类及亚型，或测其耐药性冯秀丽等(2007)用提取的禽致病性大肠杆菌1型菌毛免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，对46株带有1型菌毛的禽致病性大肠杆菌优势血清型分离株进行检测表明，该单克隆抗体都能与之发生特异性反应。王崇义等(2006)用单克隆抗体标记乳胶凝集试验快速检测金黄色葡萄球菌及其耐药性，具有较高灵敏度和特异性。

1.3检测寄生虫或其他病原体

 陈心春等(2007)将人隐孢子虫超声粉碎后，免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，经流式细胞术检测其反应性表明，该单抗对隐孢子虫胞内和胞外的检测无差异。孙晓林等(2008)将纯化的猪带绦虫六钩蚴45W-4BX重组抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，结果表明所获单抗能满足常规试验的要求，可用于带绦虫六钩I蚴45W-4BX抗原的组织定位。

2检测微量成分

用单克隆抗体进行酶标免疫测定或结合同位素进行放射免疫分析，可用于检测体液内微量成分（如激素）的含量，用以判断机体内分泌功能状态是否正常或判断前期治疗效果；也可用于快速检测瓜果蔬菜、食品等农产品的农药残留，外环境水体的农药污染情况，及保证对公共卫生应急事件的检测。

2.1检测机体内微量成分

白宇等(2008)将原核表达的重组马y一干扰素成熟蛋白免疫BALB/c小鼠制备单抗，用于评价y一干扰素在机体内的动态变化指标，了解传染性疾病的发生、发展、转归及机体保护性免疫反应动态规律。赵玉梅等(2008)利用重组半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2 (CRP2)为免疫原，免疫BALB/c小鼠，制备CRP2单克隆抗体，该单抗可用于监测CRP2的表达变化，对防制心脑血管和呼吸系统疾病的发生具有重要意义。

2.2检测药物残留  Ru{o等(2004)将除草剂草达灭与载体蛋白结合合成人工抗原，再通过杂交瘤产生特异性单克隆抗体，通过ELISA法可检测草达灭最低浓度达1 ng/mL，且与其他杀虫剂无交叉反应，比多抗更敏感、精确、稳定，既可增加灵敏度，又可降低交叉反应，非常适合于多组分分析。徐社会(2008)将莱克多巴胺(RAC)与BSA偶联制成人工抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，采用竞争法研制了RAC胶体金免疫层析试纸。试验结果表明，该试纸检测灵敏度为5 ng/mL，与克伦特罗、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、苯氧丙酚胺、沙丁胺醇和多巴胺的交叉反应性都小于0.03%，可用于RAC的快速检测。

3确定免疫机制，分析抗原结构，定位病原组织

单克隆抗体由于其与抗原结合的特异性及检测过程中逐级放大的特点，可以精确定位和定量抗原，是免疫学和血清学研究的重要工具，被广泛用于酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式活化细胞分选仪(FCS)、免疫印迹和免疫组化研究中，其灵敏度可达到微克(ug)水平，可利用它更全面、更细微地分析抗原结构，特别是分析细胞表面的小分子抗原，对分析体内免疫反应机制、判断机体免疫水平和免疫调

节平衡状态具有重要的实际意义。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内进行放射免疫显像，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定位诊断。Costa等(2007)利用乙型野田村病毒属(Betan- odavirus)的单克隆抗体结合“肽扫描技术”(Pep- scan)进行乙型野田村病毒衣壳蛋白B淋巴细胞抗原决定簇的识别鉴定，为该病毒的疫苗开发和免疫学诊断试剂的研制提供了资料。Yuki等(2000)使用抗牙鲆IgM的单抗，通过流式细胞分析技术检测Sig( surface immunoglobulin-positive)细胞在成年牙鲆脾脏、肾脏的分布，从而研究脾与肾作为免疫系统的区别，并提出了肾脏是B淋巴细胞分化为浆细胞的场所。

4在肿瘤诊疗中的应用

在医学诊断方面，单克隆抗体可用于肿瘤的诊断、分型和定位；可区分不同细胞的亚群和分化阶段，了解细胞的来源、分布和功能，以制定有效的治疗方案；可用于主要组织相容性抗原HLA系统的分型和ABO等血型的鉴定。在临床治疗方面，单克隆抗体可作为被动免疫而用于治疗；也可作为载体与各种类型的细胞毒制剂结合，直接导向定位于肿瘤细胞以提高抗体的疗效，降低细胞毒制剂的非特异性毒性反应；同时，单克隆抗体还可作为预防手段，用于骨髓移植和器官移植，以预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)、排斥反应及肿瘤细胞的致病作用(Drewe等，2002)。

5用于蛋白质的提纯

单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质上，并制备成层析柱，当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。Disco等(1985)用此法制成单克隆抗体亲和层析柱，用于提纯大豆花叶病毒并获得成功。Schieber等(1997)制备了10株葡萄斑点病毒(grapevine fleck virus，GFKV)的单克隆抗体，并尝试利用其中的285株单抗对GFKV进行提纯，发现不仅能够得到高纯度的病毒蛋白，而且其方法要比常规的病毒提取方法简单得多。

6  单克隆抗体面临的问题

单克隆抗体用途广泛，发展迅速，在生物学、医学和其他研究领域中显示了极大的应用价值。随着研究和应用的进一步深入，单克隆技术无论是在生产技术方面还是在应用方面都存在一些问题需要解决。相信随着这些问题的解决，单抗将有更加广阔的应用前景。

6.1如何进一步缩短单抗研发周期，降低生产成本  传统方法制备单克隆抗体包括抗原制备、动物免疫、抗体检测方法的建立、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆、冻存复苏、杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定及单克隆抗体的大量生产等一系列复杂步骤，一般要花费6个月以上的时间，研发周期较长。同时，每只小鼠自始自终只能免疫一种纯化抗原，将这种免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合后，形成的杂交瘤细胞也只能分泌针对这一种纯化抗原的单一单克隆抗体，工作效率低，生产成本高。因此，如何利用分子生物学技术，克服现有生产技术的局限性，缩短单抗研发周期，降低生产成本，建立生产杂交瘤细胞株的高效方法，是当前需解决的问题。

6.2如何进一步提高体外用单抗的品质  虽然单克隆抗体具有特异性、均一性、稳定性等优点，但在亲和性等方面还要差于多克隆抗体。研制高亲和性单抗是免疫化学技术的重要发展方向之一，将会进一步提高单克隆抗体在微量分析领域内的应用。同时，随着单抗在诊断与治疗中应用的快速发展，对单抗种类及数量的需求越来越多，如何进行大规模的生产也已成为抗体纯化的主要问题。另外，单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，体外用单抗标准化问题还需要进一步研究。

6.3  如何进一步提高治疗用单抗的品质  自1982年单抗首次应用于人体治疗以来，应用单克隆抗体治疗肿瘤、自身免疫疾病、组织器官移植排斥反应等疾病的报道渐多，但同时鼠源性单抗用于人体的毒副作用也越来越明显，使单抗在人体治疗中的应用受到很大限制，主要表现为：诱发人抗鼠( human anti-mouse antibody，HAMA)反应，在血清中半寿期短，仅有部分不同亚类的抗体能引发效应功能等。此外，肿瘤细胞群体在抗原性方面的异质性，肿瘤细胞的抗原性调变等也可能影响偶联物的疗效。在药理学方面，由于偶联物是异体蛋白，会被网状内皮系统摄取，有相当数量将积聚于肝、脾和骨髓，从而造成到达肿瘤的药量不足。因此，如何进一步降低单抗药物的免疫原性，提高单抗药物在肿瘤组织的浓度是研制治疗用单抗的发展方向。近年来，随着分子生物学技术的发展，尤其是抗体库技术、鼠抗体人源化改造技术、人源性抗体制备技术及近年利用转基因技术研制完全人抗体的突破，为单抗进入临床治疗提供了良好的应用前景。

 许保疆，游一，郭成留，张玉杨，徐引弟，朱文豪，许峰   

(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州  450002)

中国畜牧兽医2010.7