转基因玉米DNA检测芯片的研究
自从1983年第一株转基因作物问世以来，转基因作物不仅商业化种植面积迅速增加，而且其品种也日益丰富。据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5 260 hm2，15种转基因作物批准商品化，其中包括大豆、玉米、油菜、马铃薯、棉花等，用这些转基因作物生产加工的食品有近万种。与此同时，出于对对转基因作物安全性考虑，中国、欧盟、日本、韩国等国家和组织纷纷制定相应的法律和法规要求对转基因作物和加工食品进行标识，以对人、动物的健康和生态环境多样性进行保护。这就需要建立一套简便、快速、准确的检验技术以满足日常检测的要求。目前国际上常用的检测方法有PCR-电泳检测、ELISA检测、实时荧光定量PCR检测以及试纸条检测，上述方法的局限性在于对含有多个外源基因的转基因作物一次只能检测一个基因，因此费时、费力，容易造成假阴性。
DNA芯片技术具有高度并行性、高通量、微型化和自动化等优点具有广泛的应用前景。在所有转基因作物中，转基因玉米的种植面积较大，在国际贸易中占有重要的地位。为了有效地对转基因玉米进出口贸易进行监测，保证我国对外贸易的可持续性发展，本研究将多重PCR技术与DNA芯片技术相结合对转基因玉米DNA芯片检测方法进行了研究。
1材料与方法
1．1仪器
PCR仪；杂交炉；紫外交联仪；低温高速离心机；核酸蛋白分析仪；化学发光荧光可见光系统：芯片点样仪；涡旋混合仪；微量加样器。
1．2材料
转基因玉米(品系Btll，品系Btl76，品系MON810，品系T12／T25，品系CBH-351)和非转基因玉米均由美国SDI公司提供。
l.3试剂及试剂盒
植物基因组DNA提取试剂盒：Promega(Wizard Magnetic DNA Purification System For Food)；多重PCR扩增试剂盒：QIAGEN(Muhiplex PCR Kit)；核酸杂交试剂盒：Roche(DIG High Primer DNA Labeling and Detection starter Kit)；Taq酶体系：Promega；dNTPs：Promega；SSC：Promega；杂交膜：Pharmacia(Hybond-N+)。
1．4引物
通过引物设计软件(Oligo 6．0)进行引物设计，针对位点为CaMV35S启动子、NOS终止子、PAT基因、BAR基因和目的基因IVS2／PAT、CDPK／CrylA(b)、Maize genome／CaMV35S、PAT／CaMV35S!、Cry9C／CaMV35S!和内源IVR等基因片段。为进行多重PCR，在引物设计时应尽可能使它们的退火温度相尽，本研究设计的10对引物退火温度均为54℃，PCR扩增片段控制在100 bp-200 bp范围内。
CaMV35S启动子：5"-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A一3’(195 bp) 5"-GAT AGT GGG ATY GTG CGT CA一3’NOS终止子： 5"-TTA AGA TYG AAT CCT GTT GCC G一3’(180 bp) 5"-TAA qTFATCCTAGTTTGCGCGC一3’PAT 5"-GTC GAC ATG TCT CCG GAG AG--3’(191 bp) 5"-GCA ACC AAC CAA GGG TAT一3’IVS2／PAT 5"-CTG GGA GGC CAA GGT ATC TAA T-3’(189 bp) 5"-GCT GCT GTA GCT GGC CTA ATC T-3’ CDPK／CryIA(b) 5’一CTC TCG CCG TYC ATG TCC GT-3’(21 1 bp) 5’一GGT CAG GCT CAG GCT GAT GT-3’ MAIZE genome／Ca V35S 5"-TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CG-3’(170) 5"-TCC ATC TIT GGG ACC ACT GTC G一3’PAT／CaMV35S~ 5"-ATG GTG GAT GGC ATG ATG TTG-3’(209 bp) 5"-TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CC一3’Cry9C／CaMV35S 1 5"-TAC TAC ATC GAC CGC ATC GA一3’(171 bp) 5"-CCT AAT TCC CTY ATC TGG GA一3’IVR 5"-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C一3’(226 bp) 5"-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C一3’
1．5探针标记
用1．4中设计的引物对样品基因组核酸进行PCR扩增，扩增产物通过Klenow酶和DIG-dUTP，采用切口平移法进行标记，按试剂盒说明进行操作。
1．6 DNA芯片的制备
用1．4中设计的引物扩增样品核酸提取物，扩增产物通过芯片点样仪点到杂交膜上，每点点样5次，将芯片干燥、紫外交联等处理后，便得到可用于检测的DNA芯片，点样阵列见图1。
图1中芯片面积为15mmxl5mm，第l列为空白对照，第2列为内源IVR基因，第3列为CaMV35S，第4列为NOS，第5列为PAT，第6列为空白对照，每列重复6次，以保证结果的重复性和准确性。
1．7样品基因组DNA的提取
将转基因玉米纯品(阳性样品，品系Btll，品系Btl76，品系MON810，品系T12／T25，品系CBH-351)与非转基因玉米(阴性样品)分别制成质量百分比为5％、1％、0．5％、0．1％的样品。将上述样品各称取200 mg，采用基因组DNA提取试剂盒(Promega)提取DNA．具体步骤参照试剂盒使用说明。提取产物经核酸蛋白分析仪测定DNA浓度和纯度，并通过0．5％琼脂糖凝胶电泳观察产物的质量。提取DNA于-20℃冷冻保存备用。
1．8多重PCR扩增
将样品DNA稀释10倍作为反应模板，终浓度为50 ng/μ
多重PCR扩增条件：95℃变性10 min；94℃30 s；54℃退火30 s；72℃延伸1 min；72℃最后延伸40 min，共40个循环。
1．9探针的制备
将1．8中扩增产物通过缺口平移法制备探针混合物。
1．10芯片杂交和结果判读
1)预杂交：在杂交皿中加人300μL预杂交液(Roche杂交试剂盒提供)。
2)杂交：将1．9中PCR产物探针混合物100μL100℃煮沸10 min，迅速于冰水混合物中冷冻5 min,加入200μL杂交反应液(杂交试剂盒提供)涡旋混匀，加入杂交皿中．于杂交炉中45℃杂交1 h。
3)清洗：2XSSC,2X15 rain；1XSSC，3X10 min，0．1X SSC．2X15 min。
4)封闭与显色：参照杂交试剂盒说明进行。
5)结果判读：若芯片上相应位点出现蓝紫色斑点表明该样品含有该基因序列，结果通过化学发光荧光可见光系统成像保存，数据分析备用。
1．11杂交温度的优化
杂交温度的优化试验选择35、40、45、50、55、60℃6个温度梯度进行，通过杂交结果以确定最佳杂交温度。
1．12杂交时间的优化
杂交时间的优化试验选择20-,25、30、35、40、45 min
6个梯度进行，通过杂交结果以确定最佳杂交时间。
1．13杂交芯片灵敏度的测定
以转基因玉米初筛为例，将1．9中制备的地高辛标记的样品PCR反应液进行10倍，100倍，1 000倍和10 000倍4个梯度稀释，通过杂交结果以测定杂交灵敏度。
1．14芯片检测重复性的测定
以转基因玉米初筛为例，一次性制备10张芯片．并进行检测，通过检测结果对芯片的重复性进行分析。
2结果和讨论
2．1用试剂盒法获得的DNA质量可满足PCR反应的要求
采用Promega公司植物基因组DNA提取试剂盒获得的玉米基因组DNA经核酸蛋白分析仪测定0D260为0．937，OD260/280为1．996；DNA经琼脂糖电泳，结果表明DNA片段完整，没有明显的降解。
2．2检测中采用转基因玉米作为阳性对照可防止假阴性结果的出现
在对未知玉米样品进行检测时．必需以转基因玉米的芯片杂交结果作为对照，避免假阴性结果的出现．造成漏检。在芯片质量合格和杂交反应条件正常的情况下，阳性样品中的内外源基因的PCR扩增片段与芯片上相应位点的探针进行杂交可出现蓝紫色的杂交斑点，见图2和图3，若未出现斑点说明芯片质量不合格、探针浓度过底或杂交反应条件需进一步优化。
图2中，第l列为空白对照，第2列为内源IVR基因，第3列为CaMV35S，第4列为NOS，第5列为PAT，第6列为空白对照。
图3中，第1列为空白对照．第2列为内源IVR基因，第3列为‘CaMV35S，第四列为NOS，第5列为PAT，第6列为空白对照。
2．3可通过同一张芯片对不同品系转基因玉米进行鉴定
在进行转基因玉米检测时．为了节省时间和费用，提高检测效率，首先应进行阳性样品的初步筛选(见图2)。对初筛结果为阳性的样品根据转入的特异性目的基因进一步进行品系鉴定(见图4)。
图4各图中，第1列为空白对照，第2列为IVS2／PAT，第3列为CDPK／CrylA(b)，第4列为Maize genome／CaMV35S，第5列为PAT／CaMV35S!，第6列为Cry9C／CaMV35S!。
2．4影响多重PCR扩增的因素
2．4．1 PCR扩增缓冲液的影响
常规PCR缓冲液使用标准缓冲液，由1．5 mmol／L Mg2+，10 mmol／L Tris·HCl(pH 8．3)和50 mmol／L KCl组成。据文献报道TMAC、Triton-X 100：明胶能增强PCR扩增的特异性。因而，在多重PCR缓冲液中可加入1 mmol／L TMAC和0．1％Triton-X 100。
2．4．2循环参数的影响
为了使反应后加尾整齐，多重PCR的延伸时间比常规PCR(循环时延伸时间为40 s，最后延伸为5 min)长，通过反复的优化试验，我们认为循环时延伸时间为1 min．最后延伸时间为40 min扩增效果较好．扩增产物加尾整齐。
2．4．3 Hotstar DNA聚合酶的影响
在PCR起始阶段。模板量较低，在起始循环较低温度下形成非特异性配对进行非特异性延伸对目的扩增的影响尤其大。导致杂带产生甚至目的片段无法扩增。而Hotstar DNA聚合酶在常温下没有活性，需95℃激活15 min才具有聚合酶的活性，可以避免起始循环较低温度下形成非特异性配对进行延伸．大大地提高了PCR反应的特异性和灵敏度．尤其适合于多重PCR扩增中基因组模板复杂，样品量较少，目的扩增片段长度多样化等试验特点。
2．5影响地高辛探针标记的因素
使用地高辛标记系统时，可根据地高辛系统的不同用途、获得的用以制备探针的模板的类型、以及探针可达到的灵敏度，选择探针标记方法。本研究中采用了切口平移法进行探针标记，该方法快速、简便、灵敏度较高，可满足转基因植物产品检测的要求。DNA模板的纯度越高，标记的效率也就越高，因此在进行标记前应对PCR扩增产物进行回收纯化或使用苯酚、氯仿等试剂抽提DNA模板。
2．6最佳杂交温度的确定
以转基因玉米初筛检测为例，选择35、40、45、50、55、60℃6个温度梯度进行杂交试验，杂交结果见图5。
从图5中可见在35℃和40℃条件下进行杂交时，芯片本底较高，不利于检测结果的判定，在50℃、55℃、60℃条件下进行杂交，随着温度逐渐升高。杂交信号有下降的趋势，易出现假阴性结果，而在45℃条件下，芯片本底较低，同时杂交信号较强，便于检测结果的判定，因此本研究选用45℃作为转基因产品DNA芯片杂交检测的最佳温度。
2．7最佳杂交时问的确定
以转基因玉米初筛检测为例选择20、25、30、35、40、45 min 6个梯度进行杂交试验，杂交结果见图6。
从图6中可见在20 min,25 min条件下进行杂交时，由于杂交时间较短，杂交膜上的一些探针与反应液中的标记样品尚未结合或结合未达到最稳定程度，因此杂交斑点信号较弱，不利于检测结果的判定，在30、35、40、45 min条件下进行杂交，随着温度逐渐升高，杂交信号的强度均较好，但随着时间的延长，杂交膜上的本底程上升趋势，同样不利于结果的判定，因此本研究选用30 min作为转基因产品DNA芯片杂交检测的最佳时间。
2．8芯片检测灵敏度的确定
以转基因玉米初筛检测为例，将制备的地高辛标记的样品PCR反应液进行10倍，100倍，1 000倍和10 000倍4个梯度稀释，并与芯片进行杂交，杂交结果见．图7。
从图7中可见，当用地高辛标记的样品PCR反应液原液、地高辛标记的样品PCR反应液10倍稀释液、地高辛标记的样品PCR反应液100倍稀释液进行杂交时，杂交膜上的杂交斑点逐渐减弱，但均明显可见．当用地高辛标记的样品PCR反应液1 000倍稀释液进行杂交时，杂交斑点的强度下降程度较大，同一列的点样位置个别未出现杂交斑点，当用地高辛标记的样品PCR反应液10 000倍稀释液进行杂交时，杂交膜上点样位置未出现杂交斑点，因此地高辛标记的样品PCR反应液的最大稀释倍数为100倍，如再进行稀释，则不利于结果的判定，易于出现假阴性的结果。
2．9芯片检测重复性结果
以转基因玉米初筛检测为例，一次性制备10张芯片，并进行检测，通过检测结果对芯片的重复性进行分析．见图8。
从图8中可见，1号-10号杂交芯片上的相应点样位置均出现预计的杂交斑点，同时空白对照均未出现杂交斑点，说明本研究制备的转基因产品DNA检测芯片具有良好的重复性，可满足日常检测工作的要求。
3结论
基因芯片作为生命科学研究的一种新的技术平台，日益受到人们的关注，并已广泛的应用于生命科学研究的各个领域。本研究采用多重PCR对待测样品DNA进行扩增，扩增产物与制备好的DNA芯片进行杂交同传统核酸印迹杂交相比，具有快速、集成化和高通量等优点，必将成为转基因植物产品检测的主流。同时可用于疾病检测、药物靶点筛选等领域。如何通过优化反应条件提高检测的灵敏度，进一步缩短检测时间，降低成本仍有待研究。
刘烜，郑文杰，唐丹舟，赵卫东，贺艳，刘辉(天津出入境检验检疫局，天津300201)
食品研究与开发2009.6