转基因稻谷外源蛋白在肉仔鸡体内的安全评价
转基因技术在农业生产中的改良应用受到各国政府的极大关注，但人们对转基因作物的饲用或食用安全性仍存疑虑，例如饲喂转基因作物后外源基因是否会在动物体内表达?外源蛋白质是否会转移到动物组织及动物产品中，是否会通过粪便在自然界传播而引发新的危机?根据“中心法则”，遗传信息由DNA转录给RNA，通过mRNA翻译合成特定的蛋白质以执行各种生命功能，转基因的最终目的是通过特异蛋白质使生物体实现人们所期望的功能，因此检测机体组织中是否存在外源蛋白是反应所转录基因是否在机体中重组表达的重要方法。本试验采用Western blotting技术检测肉仔鸡体内器官中是否存在转基因稻谷所表达的外源蛋白，为转基因水稻品系进一步的饲用或食用安全性研究奠定基础。
l材料与方法
1．1试验材料
水稻是所有禾谷科作物中蛋白含量最低的作物之一，其必需氨基酸中所含的赖氨酸又是最缺乏的．许多科学家都在致力于提高水稻种子中必需氨基酸含量。本试验所有的高赖氨酸转基因水稻由扬州大学江苏省植物功能基因组学国家重点实验室提供。该水稻系将编码泰国四棱豆的高赖氨酸含量蛋白(Lvsine- rich protein，简称LRP)及其与水稻谷蛋白组成的融合蛋白(Gt：LRP fusion protein，简称FB蛋白)的基因导人中国大陆的高产水稻品种中，使目的基因在水稻种子中高效表达，经品质测定和大田选育，获得富含赖氨酸蛋白的转基因水稻新品系。高赖氨酸转基因水稻及其亲本均为当年生产的新稻，在种植、暴晒、贮存和加lT过程中彼此严格分开，避免任何可能的混合与污染，试验前贮藏于阴凉通风干燥处。
1．2试验设计与日粮组成
将200只初始体重无显著差异的1日龄AA肉仔鸡随机分成2个处理组，每组100只，设5个重复，每个重复20只，公母各半，试验组肉仔鸡饲喂转基因稻谷日粮，对照组饲喂非转基因稻谷日粮。配方参照快大型肉仔鸡饲养标准，饲料为粉状，预混料由江苏南通大英饲料有限公司提供。各日粮配方及营养水平见表1。
1．3饲养管理
试验前鸡舍严格消毒，采用网上平养，自由采食与饮水，舍内温湿度、光照等严格按常规饲养管理要求进行，并按常规免疫程序免疫。试验期间详细记录各组鸡群健康状况及死淘数量。
1．4样品采集
42日龄各组随机取点采集鸡粪样品，-70℃保存。全群称重并计算各组平均体重后，每组随机抽取10只(公母各半)接近平均体重的鸡(每重复2只1，空腹12 h屠宰，每只鸡在无菌条件下心脏采血5 ml,加肝素钠抗凝,-70℃保存；肝脏、肾脏、胸肌和腿肌用无菌生理盐水洗净血污,-70℃保存；腺胃、肌胃剪下一小口．另取小肠各段(十二指肠、空肠、回肠)中部约1 cm挤出内容物，用无菌生理盐水洗净，密封于无菌的自封袋中，-70℃保存。
1．5 Western blotting检测
Western b10tting的原理是抗原抗体的特异性结合，其主要步骤是将从待测样品中提取的分子大小不同的蛋白质(抗原)用凝胶电泳的方法分离后，将其转移到固体支持物上，用标记的抗体作探针与之杂交，通过放射性自显影等技术检测食品中转基因的表达产物。Western印迹法将电泳的分离能力、抗体的特异性和放射性自显影的灵敏性结合起来，对蛋白分析有较好的效果。由于该方法需要对蛋白质进行变性凝胶电泳，可以消除蛋白溶解、蛋白凝聚和非目标蛋白与靶蛋白共沉淀等问题，因此Western印迹法是检测复杂混合物中特异蛋白质的最有力工具。
1．5．1 电泳样品的制备
将存放于-70℃冰箱中的稻谷、饲料、粪便、血液、肌胃、腺胃、小肠各段肠壁、胸肌、腿肌、肝脏、肾脏样品置于4℃下解冻，捣碎，低压冻干过夜。分别称取50 mg的样品置于无菌离心管中，按鲜重1 mg：15μ
1．5．2 SDS-PACE电泳及转移
根据测得的总蛋白浓度，每例样品吸取总蛋白30μg，5％SDS-PACE浓缩胶30 V恒压下电泳45 min；12％SDS-PACE分离胶75 V恒压下电泳150 min，然后按照Bio-Rad装置说明组装好“海绵一滤纸一凝胶一硝酸纤维素膜一滤纸一海绵”的“三明治”，44 V恒压转移75 min(高淑敏，2008)。
1．5．3免疫反应
试剂盒购于美国ICN生物药品有限公司，按试剂说明进行操作。将硝酸纤维素膜置于PBS摇晃5 min；取出后，置于Blocking buffer，摇晃45 min；将膜转入B10cking buffer中，以1：1 000比例加入一抗，摇晃45 min：取出膜，在Wash buffer中洗，摇晃2x10 min；将膜转入Blocking buffer中，以1：10 000比例加入二抗．摇晃45 min；取出膜，在Wash buffer中洗，摇晃2x10 min：将膜转入1xAssay buffer中摇晃2x2 min。将膜取出，封装于塑料袋中，将新配好的Opti-Mem- braneTM和StarLightTM(75 ixl+1．5 m1)加入膜正面，将另一口封好，压于Kodak制片板中。试验所用抗体由扬州大学江苏省植物功能基因组学国家重点实验室刘巧泉老师惠赠。
1．5．4显影定影
将制片板和Kodak XAR x-ray底片带人暗室，剪合适大小的底片，置于膜的正面，压好，置于37℃，曝光0．5 h。然后在暗室中取出底片、显影、定影、晾干。
1．6图像处理
用PerkinElmer公司生产的ProXPESSTM2D蛋白组学成像系统进行图片扫描。
2结果与分析
转基因稻谷和亲本稻谷种子及其对应日粮组肉仔鸡的胸肌、腿肌、肝脏、肾脏、血液、腺胃、肌胃、十二指肠肠壁、空肠肠壁、回肠肠壁、粪便的转基因外源蛋白在肉仔鸡体内的表达情况如图1所示。该外源蛋白分子量为67 kh，从图上可见除转基因稻谷及其对应的配合饲料呈阳性外，各组粪便及组织样品均呈阴性，粪便及机体上述组织样品中没有检测到该外源蛋白。
3讨论
Ash(2003)等给产蛋鸡饲喂转基因抗除草剂的豆粕，未在鸡蛋、肝脏和粪便中检测到转基因大豆所表达的抗除草剂蛋白；Jennings(2003a、2003b）等未在饲喂转基因抗虫玉米的肉仔鸡和生长猪肌肉中检测到转基因作物所表达的外源蛋白；王长康（2007)等用抗草甘膦转基因豆粕饲喂蛋鸡和番鸭并未发现在肠、胰腺、食道、肝、腺胃、肾、心脏、肌胃、肌肉、血液、蛋品、粪便中有转基因成分残留；Chowdhurv(2003)等用转基因玉米饲料喂猪未发现血液中有外源蛋白的存在。朱元招等(2005)用转基因豆粕饲喂生长猪未发现在肝脏、肌肉、脾脏和胸腺组织中有外源基因残留．外源DNA已被基本代谢降解。Deaville（2005）等用转基因食品饲喂小鸡，赵志辉(2005)等用转基因水稻饲喂大鼠,Sharma等(2006)用转基因作物饲喂绵羊等试验也得出了类似结论。本试验对转基因稻谷及其亲本稻谷种子以及其对应饲料、日粮组肉仔鸡的胸肌、腿肌、肝脏、肾脏、血液、腺胃、肌胃、十二指肠肠壁、空肠肠壁、回肠肠壁、粪便等组织蛋白进行了检侧，均未检测到转基因水稻所表达的外源蛋白，试验结果与上述报道一致。蛋白质在体内的代谢涉及蛋白质的消化、吸收以及氨基酸和肽的应用，植物基因所表达的蛋白质，通过肠胃消化后充分降解，以氨基酸的形式被组织利用，体内蛋白合成所需的氨基酸均来自于氨基酸代谢库，所以在动物组织、内脏及产品（肉、蛋、奶）中一般不可能检测到植物蛋白，并且迄今为止，未见饲喂转基因植物的动物产品中检测到外源蛋白质的报道。2008年3月欧盟食品安全局宣称，禽类采食转基因饲料后所生产的鸡蛋和肉类中无基因残留的痕迹。王长康等(2007)认为粪便中转基因作物外源蛋白残留与其在日粮中添加量密切相关，只要掺人的转基因作物含量在适当范围内，能被动物机体充分消化、降解，就不会在粪便中残留。从本试验结果可以看出，转基因稻谷所表达的外源蛋白质能被动物机体充分消化。不会通过粪便排泄扩散到土壤中而对环境产生危害。
4小结
采用Western blotting方法对饲喂转基因稻谷及其亲本稻谷种子及其对应饲料、日粮组肉仔鸡的胸肌、腿肌、肝脏、肾脏、血液、腺胃、肌胃、十二指肠肠壁、空肠肠壁、回肠肠壁、粪便的转基因外源蛋白在肉仔鸡体内的表达情况进行了检测，未在肉仔鸡体内及其粪便中检测到转基因稻谷所转录表达的外源蛋白．转基因稻谷中的外源蛋白能被机体消化分解。日粮转基因稻谷中的外源基因不能在机体内介导生成外源结构蛋白。
周联高 刘巧泉 张昌泉 章世元
饲料工业2009.9