转基因产品定性PCR检测的技术要点
随着全球和我国植物转基因品种的推广应用，种子市场必然会出现以假冒真或劣质转基因品种的高价销售问题。这就需要对种子市场的转基因品种进行真假鉴定。目前国家制定了许多有关转基因产品检测的方法标准，有的以国家推荐性标准发布实施，有的以农业部公告发布实施，有的以农业行业标准发布实施。这些标准涉及的作物有玉米、大豆、油菜、蕃茄、马铃薯和棉花等，涉及的转基因性状有抗虫和耐除草剂等。作者根据多年实践经验，提出了成功做好每一步操作的技术要点，以供广大种子检验工作人员参考。
1试剂、仪器设备和标准物质的通用要求
1．1试剂
试剂应为不含DNA和DNA酶的分析纯或生化试剂，所用的标准物质DNA应由认可机构制备，具有证书，并有溯源性，或是具有其他的经过认证机构颁发的文件证明。对关键试剂应在使用前进行质量测定。关键试剂包括：核酸提取试剂、RNA酶、蛋白酶、阴性对照标准物质DNA、阳性对照标准物质DNA、Taq酶、引物等。质量检测包括：(1)有无污染，是否存在假阳性；(2)使用弱阳性对照标准物质检测试剂的扩增效果。所配置的溶液需要高压灭菌保存，且在容器上注明试剂名称、浓度、配置时间、保存条件、失效日期及配置者姓名，不宜高压灭菌的试剂应使用超滤设备除菌；商品化试剂盒应注明到货日期，且按规定的储存条件存放；试剂的保存都应该有防污染措施。用于PCR扩增的试剂应冰冻保存。
1．2仪器设备
所有仪器设备应避免植物DNA和核酸酶的污染；所有仪器设备，尤其是取样器等与试验样品接触的器具，应清洁，不对样品造成污染；盛装样品的容器或包装袋应为一次性使用的，以避免交叉污染。粉碎样品时的器皿应单独使用，所用的器具在使用前应经过彻底清洗并高压灭菌，防止交叉污染。
2样品DNA提取技术要点
2．1样品的预处理
接到待检测样品，检验员应充分混匀样品后制备测试样品。根据样品的状态和特性选用相应的预处理方法。固态样品宜先粉碎成理想大小的颗粒，或用液氮研磨至DNA充分释放并满足DNA提取的技术要求；液态样品宜用缓冲液或水充分洗涤，直至其中的DNA完全溶于缓冲液或水中为止。样品的预处理过程应小心操作，确保防止任何的污染和样品组分的改变。
2．2样品的设置
样品必须设置两个提取平行样，同时设置提取空白对照(水代替样品)、阴性提取对照、阳性提取对照和环境对照。
2．3 DNA的提取与纯化
为了获得高质量的DNA，提取过程中可以选择使用合适的酶，比如果胶酶、纤维酶、半纤维酶、淀粉酶、RNA酶或者蛋白酶等，它们分别去除果胶、纤维、半纤维、淀粉、RNA或者蛋白质等。对于固体或者干燥的样品，细胞分裂缓冲液或抽提缓冲液的体积应足以保证DNA的溶解。DNA的纯化可以通过酚、三氯甲烷、乙醇、异丙醇等少量溶剂来沉淀，或吸附在固体材料上(阴离子交换树脂、硅藻土、玻璃胶或膜等)。沉淀的DNA经过洗涤后，应彻底干燥后，才能用缓冲液或灭菌去离子水溶解，否则DNA溶解的效果差。无论采用哪种方法提取DNA，检验员都要小心操作，防止样品间相互污染。同时要穿实验服和戴手套，手套要经常更换，尤其在提取DNA过程中每一步之间都要更换，试验服要经常清洗。
2．4 DNA质量的检测
2．4．1 用琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子质量
用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，以溴酚兰为示踪染料，溴化乙锭染色，紫外灯下观察和照相，同时上样已知分子质量的DNA，以此为标准，即可判断所得DNA的平均分子质量。高质量的基因组DNA在凝胶电泳上显示为单一条带，如果DNA降解则表现为弥散条带。
2．4．2 DNA浓度和纯度测定
将DNA适当稀释，测定并记录其在260 nm和280 nm的紫外光吸收率，以一个OD260值相当于50μ
2．5 DNA的保存
提取的DNA应于-20℃或-80℃条件下保存，避免反复冻融。对于需要经常使用的DNA需要分装，多管存放，需要使用时取出，融化后应该立即使用，使用结束后，剩余的DNA应在4℃冰箱短期保存，存放时间不宜超过14 d。阳性和阴性标准物质DNA可调整至常用的使用浓度后分装并冷冻保存。
3定性PCR检测
3．1对照的设置
检测时应设阳性对照、阴性对照、试剂空白对照和提取空白对照，同时应检测内源基因。
3．2检测对象
检测对象包括转基因的目的基因、启动子、终止子、标记基因等外源基因和元件。一般先利用启动子和终止子等进行筛选检测，对筛选检测结果为阳性的样品，再进行外源结构特异基因或品系特异基因检测。
3．3 PCR反应体系
3．3．1 TaqDNA聚合酶
TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，其活性对Mg2+浓度十分敏感。
3．3．2模板DNA
适宜的模板量是保证特异性扩增的前提。植物基因组较大，检测单拷贝外源基因时需要较多的模板DNA量。尤其是检测结果为阴性时，不能轻易判定结果为阴性，应大幅度的加大模板DNA量，并且作一个梯度，最终找到一个最合适的模板DNA量。如果结果仍为阴性，才能判定为阴性结果。但要注意，模板量过多会降低特异性扩增效率，增加非特异性产物。目的基因在模板DNA中占的比例越高，非特异性产物越少。
3．3．3 引 物
引物浓度不宜偏高，一般为0．1～O．5μmol／L。引物浓度过高会产生两个问题，一是容易引起错配和产生非特异性扩增，二是容易生成引物二聚体。这一点对于转基因产品鉴定来说很重要，因为植物基因组很大，而单拷贝的外源基因在基因组中所占的比例很小，这时若引物浓度高，非特异性扩增极易发生。
3．3．4底物dNTP
dNTP的终浓度一般为20～400μmol／L。dNTP浓度对产物特异性有重要影响，dNTP浓度过高，碱基的错误掺人率增加，低浓度的dNTP可提高特异扩增的精确性。另外，反应中4种底物的浓度应相同，若其中1种核苷三磷酸的浓度明显与其它3种不同时，不管是大于还是小于，都会诱发碱基的错误掺入，降低合成速度，以至过早地终止延伸。
3．3．5 PCR反应缓冲液
缓冲液中的Mg2+浓度对PCR十分重要，它影响引物的退火程度、模板与引物链的解链温度、酶的活性、酶的准确性、产物的特异性及引物二聚体形成等诸多过程。Mg2+浓度高时非特异性扩增产物积累，浓度低时产物量下降。特别需要指出的是反应体系中的EDTA等螯合剂及磷酸根均影响Mg2+浓度，EDTA等螯合剂能与Mg2+螯合，使其浓度降低，而磷酸根能定量与Mg2+结合。一般EDTA等螯合剂来自模板DNA溶液，若样品中含有EDTA等螯合剂时，就要适当增加反应体系中的Mg2+浓度。磷酸根主要来自模板DNA、引物和底物dNTP，其中dNTP是主要的，一般原则是反应体系中Mg2+的终浓度至少要比4种dNTP总浓度高O．5～1．0 mmol／L。
3．3．6石蜡油
石蜡油可以防止反应时液体挥发，使用具有加热帽的PCR仪时不必封石蜡油。
3．4 PCR扩增应注意的问题
PCR反应是一个比较复杂的过程，被扩增产物的特异性与反应体系中各成分之间动态的相互关系相关，因而很多因素都影响PCR结果。对外源基因进行初次扩增时，可先按标准中的条件进行，然后根据扩增结果加以改进。初次进行PCR扩增时容易出现如下问题：(1)没有得到特异性扩增。可能的原因有酶变性失活、模板变性不充分、引物不正确或试剂失效。出现这种情况时，可先增加预变性时间，若仍无效，则应换用新试剂。(2)电泳图谱上无清晰的扩增条带出现，而是呈降解片断。出现这种现象主要原因是模板过量，应减少模板及酶用量。(3)产物特异性不强。应减少引物量及提高退火温度、减少Mg2+浓度。(4)出现引物二聚体条带。首先检查引物是否存在3端互补的问题，如果无此问题，应减少引物量及循环次数，增加原始模板量及提高退火温度。
3．5电泳条件及扩增结果分析
采用琼脂糖凝胶，凝胶浓度为20g／L，按每100ml琼脂糖凝胶溶液中加入5μl EB溶液的比例加入EB溶液。取PCR扩增液5—15μl与适量加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2～5 V／cm条件下电泳。正确扩增的电泳谱带应是：(1)空白对照中无任何扩增条带出现，若出现扩增条带，则表明试剂中有DNA污染。(2)阳性对照应呈现一条清晰的特异性扩增条带，其大小应与预期扩增片段大小相同。(3)阴性对照应不产生与外源基因有关的特异性扩增条带，但由于植物基因组较大，DNA序列十分复杂，在扩增条件不佳时会出现一些非特异性扩增条带。(4)试样中若产生与阳性对照相同的特异性扩增条带，则可初步认为其基因组中含有该转化体特异性序列。样品也会出现非特异性扩增条带，这些条带的位置应与阴性对照中的相同。
张文玲(河南省种子管理站， 郑州450002)
种子2009.2