小麦转基因技术研究及其应用
O引言
小麦作为最重要的粮食作物之一，是人类蛋白质的主要摄取来源；同时富含维牛素B、维生素E、纤维素及镁、磷等物质。据国际粮食政策研究所预测，世界小麦需求量将以每年1.6%的速度增长，2020年将达到8.41亿吨。届时中国小麦需求量约为1.4--1.5亿吨，比2001年产量增加4 600--5 600万吨，增长49%--60%。建国以来，中国已培育出小麦品种2 000多个，实现品种更新换代6-8次，单产从645 kg-hm-2提高到4 275 kg.hm-2，为保障中国粮食的有效供给作出了巨大贡献。但近十多年来，小麦产量提高速度趋缓，单产处于徘徊状态。鉴于目前耕地面积不断减少和人口的持续增长，中国小麦生产依然面临很大的挑战。植物转基因技术可以按照需要，将不同物种来源的目的基因进行人工重组和遗传转移，打破了物种间基因交流的界限；能够克服远缘杂交造成的不结实、不育，充分利用基因资源，缩短育种周期。自1983年获得第一株转基因烟草以来，植物转基因技术发展迅速。目前，大豆、玉米、油菜、棉花等转基因作物已进入商品化生产，取得了显著的经济和社会效益，转基因作物种植面积每年都以10%以上的速度递增，由1996年的170万公顷增加到2007年的1.143亿公顷。
小麦是最后一个转化成功的重要禾谷类粮食作物，一方面由于小麦属于六倍体作物，遗传背景复杂，基因组相对较大（约16 000 Mb），是玉米的7倍，水稻的35倍；另一方面，小麦遗传转化过程中DNA导入频率低且转化后再生能力不高，有较强的基因型依赖性。自1992年成功获得第一例转基因小麦以来，转基因小麦研究在降低转化的基因型依赖性、提高转化效率、小麦转化新方法等方面均取得长足的进展。本文概述了小麦转基因技术的研究现状及其在小麦遗传改良中的应用，并对当前小麦转基因技术存在的问题进行了讨论。
1小麦转基因技术的研究现状
小麦转基因方法大体可以分为两大类：一是不依赖于组织培养的转化法，如花粉管通道法、显微注射法等；二是依赖组织培养的转化法，包括基因枪法、农杆菌介导法、电击穿孔法、PEG法等。笔者对国内外主要学术期刊发表的小麦转基因文献进行统计，发现应用较为广泛的是基因枪法(68.8%)和农杆菌介导法(15.9%)，花粉管通道法等其它方法占15.3%。高效植物转化系统应具备转化方法不受基因型限制，且便于操作；受体组织具有较强的分化和再生能力；筛选方法高效、可靠，以期获得稳定遗传的转基因植株；此外，转化过程中应避免非目标片段的整合以及由多拷贝导致的共抑制现象。再生体系建立是基因枪法、农杆菌介导法等转化方法的基础，小麦再生体系研究起初以悬浮培养细胞和原生质体为受体，鉴于幼胚再生能力强、周期短，幼胚成为当前小麦遗传转化受体的首选。但幼胚受小麦生长季节限制，即使温室栽培，也给小麦遗传转化研究带来众多不便，Patnaik等和Chugh等分别尝试以成熟胚和5日龄幼苗叶片基节诱导愈伤为受体，并取得明显效果，丰富了转化受体类型。
1.1基因枪法
1992年，Vasil等利用基因枪获得了世界首例抗除草剂转基因小麦，开创了小麦遗传转化的新纪元。在随后的短短数年，通过基因枪法相继将多个改善小麦农艺性状的功能基因转入小麦。Sudhakar等将一种便携式基因枪成功用于水稻遗传转化，该装置造价便宜，无需真空操作，若能用于小麦遗传转化，将有利于基因枪法的进一步普及。
研究发现小麦基因枪法转化效率主要取决于小麦再生体系的效率。在转化过程中，加入氯化钙和亚精胺能提高核酸与微弹的结合力，选择合适的转基因表达载体及受体组织，优化基因枪轰击参数（包括轰击距离、氦气压、真空条件等）可有效提高基因枪的转化效率。同时，小麦供体应避免病虫害侵染及不适宜的温度、湿度等，否则会影响供体组织的生理状况和转化时的细胞全能性。根据载体本身的特点，Uz6等采用与Bar共转化的方法评估了线性、环状、双链、单链等DNA类型对转化效率的影响，发现线性双链和单链DNA的转化效率明显高于环状DNA。基因枪法具有宿主广泛、可控性强、操作简便等优点。然而，基因枪法在轰击过程中容易导致骨架载体的插入、DNA断裂和多拷贝整合等。另外，外源基因是随机整合到宿主染色体上，染色体的位置效应或基因的多拷贝整合，会造成外源基因在表达水平上存在一定的差异，甚至可能导致基因沉默。
1.2农杆菌介导法
Hiei等于1994年利用农杆菌介导法将GUS转入水稻，开启了禾谷类作物农杆菌转化的先河。随后，第一例农杆菌介导的转基因小麦于1997年获得成功；Xia等和Weir等也分别报道了利用农杆菌介导法获得转基因小麦植株，并证明外源基因能够稳定表达和遗传。
在小麦农杆菌转化体系中，受体基因型、农杆菌细胞的浓度、接种及共培养时间、载体类型、筛选方式等都会影响转化效率。2003年Hu等对基因枪法和农杆菌介导法的小麦转化效果进行了比较，结果发现，农杆菌介导法的转化效率为4.4%，高于基因枪的3.4%；获得单拷贝转基因植株的几率(>60%)为基因枪法(20%)的3倍多。此外，农杆菌介导法还具有操作简单、成本低、整合位点较稳定，并能转移一些相对较大的DNA片段等优点。近年来农杆菌介导法已广泛用于小麦遗传转化。
2小麦转基因技术应用现状
目前转基因小麦主要涉及抗病、抗虫、抗逆、品质改良、提高产量等，应用较多的为抗病(39.7%)和品质改良(25.6%)方面（图）。
2.1抗病转基因小麦
小麦在整个生长期内，常受到锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病、黄花叶病毒病等多种病害的危害，仅真菌病害每年可造成减产5%--10%。利用转基因技术培育的抗病转基因棉花、玉米等作物已广泛应用于生产。尽管转基因抗病小麦尚未进入商品化生产，但是，小麦抗病转基因研究成为了小麦分子改良的热点，约占39.7%（图）。目前，利用抗病以及防御反应相关的基因已经获得一些具有潜在利用价值的转基因小麦材料（表1）。
应用于转基因小麦的抗病基因包括：(1)抗病及病程相关蛋白类基因，如几丁质酶基因和B一1，3葡聚糖酶基因、SGTl、RARI、类甜蛋白基因等。例如，大麦几丁质酶II基因可显著提高小麦对白粉病和赤霉病的抗性。Oldach等将大麦几丁质酶II基因和巨曲霉菌抗菌蛋白基因Ag-AFP共转入小麦，转基因株系明显降低了白粉病菌和叶锈菌孢子的形成。(2)抗菌肽及抗菌蛋白类基因，如核糖体失活蛋白基因、KP4等。Clausen等将病毒基因KP4转入小麦，获得抗黑粉菌属真菌的转基因小麦材料。(3)植保素类基因，如芪合酶基因等。梁辉等[351将芪合酶基因转入春小麦品种京红5号，并从T3代中鉴定出1个对白粉病免疫植株和3个中抗白粉病植株。(4)抗病毒类基因，如病毒复制酶和外壳蛋白基因、自裂殖酵母来源的Pac 、大肠杆菌来源的突变核糖核酸酶基因等。徐惠君等通过基因枪共转化法将小麦黄花叶病毒复制酶基因WYMV-Nib8导入扬麦158，经过6代功能鉴定，获得4个高抗小麦黄花叶病且稳定遗传的小麦转基因新品系，已进入生产性试验阶段。董槿等也获得了含有小麦黄花叶病毒外壳蛋白基因的抗小麦黄花叶病毒小麦转基因株系。Zhang等每大肠杆菌来源的突变核糖核酸酶基因mc70转入小麦，创建了高抗大麦条纹花叶病毒的小麦新种质。(5)真菌酶及毒素抑制基因，如多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白( PGIP)基因等。真菌侵染植物时，往往会释放一种多聚半乳糖醛酸酶，破坏植物细胞壁，PGIP能特异性结合并抑制真菌多聚半乳糖醛酸酶活性，增强植物的抗病性。Janni等对3个转基因小麦株系的PGIP表达水平、亚细胞定位及对半乳糖醛酸酶的抑制活性进行了分析，发现转基因株系中该蛋白分泌到质外体，并保持对半乳糖醛酸酶的识别特异性。接种小麦根腐病菌72 h后，与对照相比，转基因小麦株系的症状减轻46%--50%。目前，小麦抗病转基因研究多为单个抗病基因的转化，通过多种抗病基因的聚合，培育多抗小麦品种将成为小麦抗病分子育种的发展趋势。小麦赤霉病、纹枯病、根腐病等重要病害在小麦品种中缺少抗源，挖掘抗病基因，利用转基因技术创制抗病小麦材料，将成为今后中国抗病转基因小麦的研究重点。
2.2抗虫转基因小麦
虫害一直是小麦生产的重要影响因素之一。据不完全统计，危害中国麦类作物的害虫超过110种，隶属于8目40科以上，主要包括麦蚜、吸浆虫、地下害虫、麦蜘蛛、黏虫、蓟马、麦叶蜂、麦茎蜂等10余类群。其中以麦蚜危害最为严重，中国常年发生面积达1 000--1 333万公顷，造成小麦减产10%左右，虫害严重年份减产超过30% 。近年来，由于全球C02浓度不断增加、耕作制度变化等使麦蚜的繁殖能力和适应性显著增强，其危害面积和危害程度正在不断扩大并日趋严重。
如表2所列，抗虫转基因研究涉及的基因有：(1)蛋白酶抑制剂基因，如丝氨酸蛋白酶抑制基因PiN2，胰蛋白酶抑制基因BTI-CMe 等。Altpeter等将大麦胰蛋白酶抑制基因BTI-CMe转入小麦，该基因对储存害虫麦蛾有较强的抑制作用，但对小麦叶面害虫作用不大。(2)外源凝集素基因，如人工合成及来源于雪花莲的凝集素基因（gna）、半夏凝集素基因(pta)。凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白，对蚜虫等同翅目害虫有很强的抗杀作用。Stoger等将韧皮部特异启动子调控下的gna导入小麦，发现转基因株系对小麦长管蚜有抗性，目的基因表达量高于0.04%的植株可以显著降低蚜虫繁殖率，但不影响蚜虫存活率。Yu等构建了cry la和pta双元表达载体，通过农杆菌介导法转入小麦，对2个转基因小麦株系进行抗虫鉴定，蚜虫的存活率分别为对照的54%和78%，粘虫的存活率分别为对照的65%和73%。
小麦抗虫转基因研究较少，约占7.7%（图）。应用于小麦抗蚜的基因主要是gna和pta，抗蚜基因较为单一。根据Birch等的报道，二星瓢虫取食转gna马铃薯上的蚜虫后，其产卵力、卵的生存力和寿命明显降低，因而，转gna植物对生态环境的影响引起了
人们的关注。挖掘利用新的、更加安全、有效的抗蚜基因将是小麦抗虫转基因育种的重要课题。[反]一β
2.3抗逆转基因小麦
干旱、盐碱和低温等逆境是限制小麦产量的重要非生物胁迫，为了更充分利用现有耕地，提高小麦产量，小麦抗逆育种显得尤为重要。
如表3所列，小麦抗逆转基因研究大体涉及以下几类基因：(1)编码渗透调节物质及逆境中保护植物细胞的基因：如果聚糖蔗糖酶基因、甜菜碱醛脱氢酶基因、胚胎发育晚期丰富蛋白基因、△1一吡咯啉-5-羧酸合成酶]、甘露醇-1-磷酸脱氢酶等，这些基因编码产物参与植物抗渗透胁迫反应，保护植物细胞。Abebe等对甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mtlD)转基因小麦进行耐旱和耐盐鉴定，发现转基因株系在湿重、干重、株高、旗叶长度等方面均有改善。植物胚胎发育晚期丰富蛋白是植物胚胎发育后期种子中大量积累的一类蛋白质，具有高亲水性和热稳定性，与植物抗逆功能密切相关。Sivamani等将大麦胚胎发育晚期丰富蛋白基因H VAJ转入小麦，干旱条件下T3代转基因植株的水分利用效率、根部发育和地上部干重均明显优于对照。(2)细胞膜上离子排运基因，如Na+/H+逆向运转体基因等。Xue等田间试验表明，拟南芥Na+/H+逆向运转体基因(AtNHXl)可以提高小麦在盐渍地的耐盐性。(3)抗逆相关的调控基因，如DREB转录因子等。高世庆等将大豆GmDREB转录因子转入小麦，发现转基因小麦的耐旱和耐盐能力明显提高。Pellegrineschi等将拟南芥DREBlA转化小麦，对2周龄幼苗进行干旱处理，发现转基因小麦的耐旱性明显高于受体品种（推迟10d萎蔫）。小麦抗逆转基因研究约占转基因小麦研究的12.8%（图），多集中于一些与抗逆相关的功能基因，如甜菜碱醛脱氢酶基因、Na+/H+逆向运转体基因等，这类基因可以在一定程度上提高小麦的抗逆性。但植物抗逆（耐旱、耐盐碱等）性状多属于多基因控制的数量性状，单个功能基因的导入对植物抗逆性往往很难有质的提高。随着植物逆境胁迫信号传导及基因表达调控研究的深入，发现一些转录因子在逆境胁迫条件下可以激活一系列抗逆相关的基因表达，对提高植物的抗逆性起着关键作用。Maruyama等利用基因芯片技术，以DREBlA转基因拟南芥植株为材料，鉴定出38个DREBlA下游基因，这些基因大都参与改善转基因植株的非生物胁迫耐性。近年来，利用抗逆相关的转录因子提高植物的抗逆性受到广泛关注，2009年日本国际合作局(JICA)批准了资助巴西转基因耐旱大豆开发的项目，该项目由JIRCAS和巴西农业研究公司(EMBRAPA)合作攻关，由JIRCAS提供相关DREB，目前该研究进展顺利，并将于2009--2010年进行耐旱性评估试验。
2.4改良小麦品质
随着人们生活水平的不断提高，小麦品质改良越来越受到重视。关于转基因小麦品质改良研究的报道较多（占25.6%）（图）。主要涉及以下几方面：(1)优化面筋强度，麦谷蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白的重要组成部分，与面筋强度密切相关，Blechl等利用高分子量谷蛋白亚基基因启动子，在小麦品种Bobwhite中表达高分子量谷蛋白亚基基因DyJD：Dx5，结果表明，DylO:Dx5可有效提高种子中麦谷蛋白含量。其后，许多研究者开展了高分子量谷蛋白亚基基因的转基因研究，主要集中在1Axl、1Dx5和J，DylO等亚基基因。(2)改善籽粒硬度，籽粒硬度是小麦重要的品质性状之一，主要影响磨粉品质和食品加工品质。用于改善籽粒硬度的基因有PinA和PinB等。Martin等将Pina-Dla转入小麦品种Bobwhite，3个转基因小麦株系随着Pina在转录水平表达量升高，籽粒硬度明显变软，但谷物蛋白成分及千粒重等指标与对照相比并无变化。(3)优化营养成分，如利用赖氨酸合成关键酶基因DapA ，支链淀粉酶II a、b基因等改善营养成分。小麦中可食性纤维与直链淀粉的含量相关，Regina等通过抑制小麦支链淀粉酶II的活性来提高直链淀粉含量，老鼠喂养试验显示，高直链淀粉含量的转基因小麦对老鼠健康有益。目前，在小麦营养成分改良方面研究较少，但在水稻、玉米、大豆等作物中通过转基因技术增加蛋白、淀粉、油份及必需氨基酸的含量，添加维生素、矿物质等已取得较大进展，对今后小麦转基因是很好的借鉴（表4）。
2.5提高小麦产量
高产是小麦遗传改良最重要目标之一，小麦产量由穗粒数、千粒重、有效分蘖数以及株型等多种农艺性状决定，属多基因和环境协同控制的复杂数量性状。目前对产量相关的分子调控机制了解尚不充分，高产转基因小麦育种还处于探索阶段：(1)转入植物光合作用中的关键酶基因，提高小麦光合作用，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc)。陈绪清等将玉米pepc转入小麦，发现部分转基因株系叶片中的PEPC酶活性提高了3--5倍，光合速率有所提高。(2)改善小麦分蘖、根部发育及延缓小麦叶片衰老等，如玉米侧芽分枝基因（TB1）、红花菜豆赤霉素2氧化酶基因、根癌农杆菌来源的异戊烯基转移酶基因等。奚亚军等分别利用花粉管通道法和农杆菌介导法将叶片衰老抑制基因PSACJ2-IPT导入小麦，对小麦叶片细胞分裂素和叶绿素含量、叶片衰老进程及农艺性状等进行综合分析，初步证明转基因小麦的叶片衰老受到明显抑制。(3)提高小麦胚乳中的淀粉含量，如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因（Shrunken2）。淀粉占小麦籽粒干重70%左右，淀粉含量直接决定小麦产量，而ADP-葡萄糖焦磷酸化酶决定小麦籽粒中淀粉的合成效率。玉米Shrunken2的转基因小麦株系与对照相比，单株籽粒产量增加38%，生物产量增加31%。
分子育种将是提高作物产量的有效手段之一，寻找与高产相关的功能基因对作物高产育种具有重要理论意义和应用价值。Song等成功克隆了控制水稻粒重的数量性状基因GW2，GW2功能缺失或降低时，降解与细胞分裂相关蛋白的能力随之下降，从而使细胞分裂加快，谷粒谷壳的细胞数目增加，进而显著增加水稻谷粒的宽度、加快籽粒灌浆速度、增加粒重及产量。Huang等首次阐述了DEP1在中国超级稻增产中起到的关键作用，DEP1的突变等位基因depl普遍存在于中国东北和长江中下游地区的高产水稻品种中，dep1能促进细胞分裂，使得稻穗变密、植株半矮化、枝梗数增加和每穗的籽粒数增多，从而提高水稻产量；研究还发现该基因同样在小麦穗发育过程中起着重要作用。这些研究成果可为高产小麦转基因育种提供新途径和新的基因资源。
2.6其它应用
小麦转基因研究还拓展到雄性不育、转座子标签和牛物反应器开发等方面。De Block等将解淀粉芽胞杆菌来源的barnase转入小麦，分别配以水稻和玉米花药绒毡层特异表达启动子，获得小麦雄性不育植株，便于小麦杂种优势的应用和推广。Takumi等将玉米Ac、Ds转座子转入小麦，开发小麦Ac/Ds转座子标签系统。St6ger等通过基因枪将单链抗体T84.66基因转入小麦，将小麦改造为生物反应器，转基因小麦叶片和种子中重组蛋白的表达量高达30 ug．g-1。
3小麦转基因研究存在的问题及展望
3.1提高小麦转化效率，丰富受体基因型
与双子叶植物甚至水稻等粮食作物相比，小麦转化效率相对较低，多为0.1%一3%，小麦转基因技术有待进一步优化。最近，Uz6等和Wright等分别用线型DNA和pmi筛选标记来提高小麦的基因枪转化效率，并取得很好效果。据了解，立码格兰、杜帮等公司的小麦转化效率已经达到10%以上。其次，目前小麦转基因研究所用受体大都选择Bobwhite等少数几个基因型，虽然Bobwhite等基因型的再生能力强、转化效果好，但农艺性状较差。因此，从推广小麦品种及优良新品系中筛选转化效果好的基因型，对快速实现转基因小麦的产业化具有重要意义。近年来中国科学工作者从中国国内小麦各主产区的推广品种中已经筛选到一些再生能力强，适宜进行小麦转化的受体品种，如轮选987、科农199、扬麦158、扬麦12、CA97033等，并获得一大批转基因小麦材料，为推动中国转基因小麦研究发挥了重要作用。
3.2挖掘、鉴定有重要育种价值的基因
尽管中国小麦转基因研究已经有了很大发展，但是，具有自主知识产权的有育种价值的重要基因不多。目前，拟南芥、水稻、大豆等植物全基因组序列已经发布，海量的基因序列信息为规模化挖掘、鉴定重要基因提供了基础，国外开始利用这些基因信息大规模进行遗传转化，鉴定具有育种价值的关键基因，并形成专利。据不完全统计，中国目前获得的基因专利总数不足美国的10%，差距很大。为此，需要进一步加强有重要利用价值基因的挖掘和克隆工作，特别是那些与高产、优质、抗病虫和抗逆性等农艺性状相关的基因，以期为小麦分子育种提供重要的基因资源。
3.3加强遗传转化的机制研究
小麦转基因过程中的多拷贝、基因沉默等现象增加了下游育种工作的难度。随着小麦分子改良的开展，关于转基因沉默的报道也越来越多，主要表现为外源基因表达水平大幅度降低，各株系间差异显著，使转基因作物商品化的进程受到严重影响。因此，深入研究转化的基础理论，了解外源基因在植物染色体中的整合方式及与其它基因的互作，消除转基因沉默等研究尤为重要。Srivastava等成功利用P1噬菌体Cre-lox系统将T-DNA以单拷贝、位点特异的方式整合到小麦中，实现了目标基因的稳定定点表达，为将来解决小麦转基因过程中的多拷贝及基因沉默问题带来了新思路。
3.4优化资源配置，加强条件能力建设
转基因育种涉及基因挖掘与功能鉴定、遗传转化与材料创制、新品种培育与示范等多个环节。国际跨国生物技术公司都致力于发展规模化转基因研发平台建设，按照转基因产品研发链条，进行系统分工，通过标准化、工厂化和流水线式的研发运作模式，大规模开展基因功能鉴定、遗传转化和产品开发。例如，孟山都公司每年可以获得几十万株转基因植株，对上万个转化体进行功能鉴定。中国目前研究规模较小，力量分散，各研究单位缺乏系统分工和协作，资源和设施优势不能充分发挥作用。因此，迫切需要加强国家级设施平台的建设，建立多学科、多部门大联合的协作网络，通过系统分工，实现资源、人才、信息、技术的最佳配置，整体提高中国转基因生物研发的水平和创新能力，以应对日趋严峻的国际挑战。
喻修道，徐兆师，陈明，李连城，马有志
（中国农业科学院作物科学研究所／国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程／农业部作物遗传育种重点开放实验室）
中国农业科学2010.8