转基因植物检测技术研究进展
自1983年人类首次获得转基因植物以来．植物基因工程技术发展非常迅速。转基因作物于1987年被允许进入田间鉴定试验，1992年开始大田产量试验，1995年完成安全性评价研究，1996年进行商业化生产，当年种植面积仅为174万hm。，到了2002年，这一数字增长了33倍。据农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)2008年报告，2007年全球23个国家共种植近1．143亿公顷转基因作物．约占全球农作物种植面积的12．7％。目前。产业化的转基因作物主要包括抗除草剂大豆、抗虫玉米、抗虫棉花和抗除草剂油菜等．其他具有高产、优质、抗病、抗逆、高效吸收营养等优良性状的转基因作物也呈现良好的产业化前景。同时，转基因植物检测技术也在不断丰富和创新。快速、准确、高效、简便的鉴定技术不但有利于转基因植物新品种培育，而且节省时间和成本。目前，转基因植物检测方法可以分为3类：第一类是在整合水平上进行的检测。包括PCR检测、Southern blot检测和染色体原位杂交检测等：第二类是在转录水平上进行的检测，包括RT-PCR检测、Northern blot杂交检测等；第三类是在表达水平上进行的检测。包括组织化学染色检测、荧光蛋白检测、Western blot检测、ELISA检测、叶片退绿检测和叶片涂抹除草剂检测等。
1 外源基因整合水平检测
1．1转基因植物PCR检测
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世纪80年代中期由Mullis发展起来的体外核酸扩增技术，广泛用于外源基因检测、目的基因标记、功能基因分离和克隆等。该技术以极少量目标DNA为模板，加入目标基因特异性引物。在DNA聚合酶作用下，由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA片段得以迅速扩增。该技术可根据目的基因、标记基因序列设计PCR引物，从转基因植株中扩增外源基因片段，而非转基因植物基因组则不能扩增出相应的目标片段。
PCR技术创立以来在转基因植物检测中得到了广泛应用。如Ortiz等对转hpt基因和bar基因小麦分别进行了单引物对和双引物对PCR检测。叶兴国等对转入小麦中的nptlI基因、bar基因、GCE基因，转人大豆中的bar基因、VIPl基因，转入水稻中的hyg基因，转入草坪草中的nptlI基因等进行了PCR检测，尝试了在同一反应体系中对bar基因和VIPl基因同时进行PCR检测，鉴定出了无筛选标记转基因大豆植株。
1．2转基因植物Southern blot检测
Southern blot是由Southem等~1975年提出的DNA印迹转移技术，其原理是将限制性内切酶消化后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，变性处理，然后在高盐缓冲液中通过毛细管作用将凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维素(NC)膜上．变性的单链DNA与膜结合，烘干后即固定在膜上，然后与放射性标记的探针杂交，检测与探针具有同源性的DNA片段。Sambrook等㈣对Southern blot技术进行了改进，使该技术在转基因植物检测中得到了广泛应用，被认为是筛选阳性转基因植株最为可靠、稳定的方法，在目标基因附近选择一具有单切位点的内切酶对基因组DNA进行酶切，然后用标记的目的基因片段作为探针与消化的基因组DNA进行杂交．包含目标基因的基因组片段与探针具有同源性，可发生同源重组，从而显示出杂交信号，并可分析转基因植株中外源基因插入的拷贝数。
Ortiz等对利用基因枪介导法获得的转hpt基因和bar基因小麦进行了Southern blot检测，证明了外源基因在小麦基因组中的稳定整合和hpt作为筛选标记用于小麦转基因研究的可行性。Cheng等利用Southern blot技术对农杆菌介导法获得的小麦转基因植株进行了检测，证明了外源基因小麦基因组上的稳定整合，确认转化效率为0．1％-4．3％，外源基因整合拷贝数为1~6个，单拷贝整合植株占35％。Hu等利用Southern blot技术对农杆菌介导法和基因枪介导法获得的小麦转基因植株进行了分析，表明农杆菌介导法转化效率显著高于基因枪介导法，且转基因植株质量好、整合拷贝数少、可重复性高。Vladimir等㈣对利用农杆菌介导法转化玉米成熟胚愈伤组织获得的转基因植株进行了Southem检测，转化效率为2％-11％，外源基因整合拷贝数为1-6个，约66％的植株含有1-2个拷贝。叶兴国等[2-8a4]对转nptlI基因、GCE基因、RIP基因、BCL基因小麦，转bar基因、VIPl基因大豆，转hyg基因水稻，转nptlI基因、otsA基因芦荟等进行了Southern杂交分析，明确了外源基因整合拷贝数和在受体植物中的遗传规律。
1．3转基因植物染色体原位杂交检测
染色体原位杂交技术(chromosome in situ hybridization)从Southern和Northern杂交技术衍生而来，是重复DNA序列和多拷贝基因家族物理作图、低拷贝及单拷贝DNA序列定位的常规方法，是分子生物学、组织化学和细胞学相结合的产物。其原理是根据核酸分子碱基互补配对原则，以同位素、荧光素、Gimsa标记的DNA片段为探针与经过变性的染色体DNA杂交．具有同源序列的DNA互补配对，目标DNA在染色体上的具体物理位置即可直观显示出来。原位杂交技术最早由Gall等利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交建立起来．后来主要用于鉴定植物染色体附加系、代换系、易位系等育种材料，近年来被逐步用来检测转基因植物。
在转基因表达中，一个重要的影响因素就是位置效应，即外源基因在受体细胞基因组中的位置不但影响转入基因的表达。也影响植物内在基因的结构和表达。如果原位杂交检测显示特异的杂交信号，则表明外源基因已整合到植物染色体上，通过核型分析、分子标记等技术可确定所整合的染色体及其具体位置。目前，染色体原位杂交技术在检测水稻、大麦、小麦等转基因植物上已开始应用。Pederden等定位了转基因在转基因大麦、转基因小麦和转基因小黑麦染色体上的位置，确定了含转基因的染色体，同时研究了整合的形式．发现了优先整合位点。Pushpa等对利用农杆菌介导法获得的5个转GUS、bar、hpt或Xa21多基因水稻株系JDV88、92、105、JD7A44、YXB7进行了染色体原位杂交分析，确定了T-DNA在每个株系中插入的位置可拷贝数，T-DNA在3个株系中单位点插入，在3个株系中双位点插入。Chen等对利用基因枪介导法获得的4个转GFP基因大麦株系A、C、D、F进行了染色体原位杂交分析，明确了各个株系中GFP基因整合的染色体和拷贝数。Anand等㈣对2个转几丁质酶基因和葡聚糖酶基因T3代小麦株系进行了FISH分析，发现外源基因均为单拷贝插入。且都整合在染色体端部。
2外源基因转录水平检测
2．1 转基因植物Northern blot检测
Alwine等将Southern bolt检测技术应用于RNA研究上，并取名Northern blot。该技术利用标记的目的基因片段作探针与基因组总mRNA进行杂交，由目的基因转录而来的RNA与探针具有同源性，可发生同源重组，从而显示出杂交信号。由于总RNA或mRNA是单链状态，在进行琼脂糖电泳分离时，必须在有变性剂存在的情况下，才能防止RNA分子自身结合形成发夹形二级结构，并维持其单链线性状态。其印迹过程与Southern blot在操作步骤上基本相似。
黄晓躁等利用农杆菌介导法将番茄花叶病毒(ToMV)移动蛋白基因MP转入烟草，对转基因烟草植株进行了Northern blot等检测，证明了正义和反义ToMVMP基因在转基因烟草中的表达。Oldach等利用基因枪介导法将来源于大麦中的几丁质酶基因Chi和核糖体失活蛋白基因R／P转入小麦，并用Northern blot检测证实了外源基因在rr，代转基因小麦植株中的正常表达。Anand等㈣分别以几丁质酶基因片段和葡聚糖酶基因片段为探针，对转几丁质酶基因和葡聚糖酶基因rr2～T3代小麦转基因植株进行了Northern blot分析，确认了外源基因在部分植株中的高效转录。Shirley等对转入大豆中的Borage基因进行了检测，获得了表达y-亚麻酸的无标记转基因大豆。叶兴国等对转GCE、RIP．BCL等基因小麦植株和转bar、V／P1基因大豆植株同进行了Northern blot检测，证明了转入基因在受体植物中的正常转录，并在转基因大豆植株中发现了VIPl基因高频率沉默现象。
2．2转基因植物RT-PCR检测
RT-PCR是检测和半定量特异性mRNA的高度灵敏技术，被广泛应用于基因转录水平的分析研究。其原理是提取组织或细胞的RNA，逆转录出互补DNA(cDNA)，再以cDNA为模板，用cDNA选择区所设计的引物进行PCR扩增，琼脂糖电泳分离产物，根据标准Marker对比．鉴定扩增的cDNA(预测的cDNA核苷酸序列)，用限制性酶消化、杂交或核苷酸测序进一步证实PCR产物。RT-PCR根据用于RT的已知RNA量、用于PCR的已知cDNA量、在琼脂糖凝胶上可显带的PCR循环数能估算出所研究基因的表达程度。因其具有快速和高度灵敏性等特点，被广泛应用于基因转录分析。
Anand等㈣对转几丁质酶基因和葡聚糖酶基因小麦rr，代植株进行了RT-PCR检测，从中发现了高表达个体和基因沉默个体。鲁燕等㈣将从小麦中克隆的W6转录因子基因转入了烟草，利用RT-PCR检测了W6基因的转录情况，转基因烟草耐盐性明显提高。董建辉等从披碱草中克隆了焦磷酸化酶基因EdHPl转入了烟草，RT-PCR检测证明转基因植株耐盐性与EdHPl基因表达密切相关。
3外源基因表达水平检测
3．1 转基因植物组织化学染色检测
Jefferson等从E coli K-12中克隆出了GUS基因(B- Glucuronidase，又名UidA)，它是目前植物遗传转化中普遍使用的报告基因，GUS酶(葡萄糖苷酸酶)具有稳定性高、pH值范围广、耐受性强、活性检测方便等特点，催化X-Gluc(5一溴一4一氯一3一吲哚葡萄糖醛酸苷)的水解反应，在植物组织内产生深蓝色、难溶解的化合物，表现为蓝色斑点。根据蓝色斑点的数量、强弱和频率可判断转化效果或转化效率。
对转化后的材料进行方便、快捷、直观的检测是建立特定植物转化体系的重要环节，尤其是农杆菌介导法．存在着’强烈的植物基因型特异性。不同品种对农杆菌的敏感性差异显著，农杆菌菌株、侵染液组成等对转化效果影响也很大。选取合适的报告基因可在转化后随时对受体组织进行检测．有助于及时改进和优化各个影响因素，提高农杆菌转化效率。
Soryu在转基因黄瓜T0-T1代的子叶、花粉和胚珠中检测到GUS活性，随着组织的成熟、衰老，GUS表达逐渐停止。Cheng等对农杆菌侵染后的小麦幼胚愈伤组织及后来获得抗性再生植株的叶片、子房和未成熟种子等进行了X-Gluc染色检测，结合分子检测结果，建立了农杆菌转化小麦幼胚的技术体系，发现干燥共培养处理可明显提高GUS基因瞬间表达率或农杆菌侵染效果。Zhang等和Thomas等分别对转GUS基因大豆进行了组织化学染色检测，结果表明，利用Glufosinate和Glyphosate作为筛选剂能够获得大豆转基因植株。Brisibe等对小麦花药来源的胚性愈伤组织进行了基因枪转化，组织化学染色检测后认为小麦花药来源的愈伤组织可用于转化受体。本课题组以携带GUS基因(包含内含子)的农杆菌分别转化小麦、水稻、芦荟、草坪草，对愈伤组织、叶片、小穗、花药、未成熟种子、茎段等进行了X-Gluc染色检测，以GUS基因瞬间表达和稳定表达作为主要依据之一．筛选出对农杆菌侵染敏感的小麦基因型和草坪草基因型．建立了农杆菌转化芦荟的技术体系，预测了BIBAC2载体携带多基因转化水稻的前景。
3．2转基因植物荧光显微检测
绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是来源于多管水母属(Aequorea victoria)体内的一种天然发光蛋白。野生型GFP发光较弱，加工改造后的GFP在植物中能够正常表达并且加强了荧光信号，无须任何底物和外源辅助因子就能显现。GFP在植物体中形成生色团，荧光检测该基因，其编码产物绿色荧光蛋白在荧光显微镜下清晰可见。由于GFP荧光较为稳定，较抗光漂白，在植物体中能够稳定存在。其作为新的报告基因在转基因植物研究中得到了广泛应用。
Carlson等利用基因枪介导法轰击大麦小孢子来源的愈伤组织，跟踪愈伤组织和再生植株中的绿色荧光信号．将GFP基因导人大麦。Chen等旧进一步对转基因大麦中的GFP基因进行了绿色荧光表达研究和染色体定位。Vladimir等利用农杆菌介导法转化玉米成熟胚来源的胚性愈伤组织，抗生素筛选结合组织中绿色荧光观察，将GFP基因转入了玉米．首次建立了农杆菌介导法转化玉米成熟胚的技术体系。倪志勇等将GFP基因与来自小麦的TaDREB6转录因子基因构建了融合表达载体，利用基因枪轰击洋葱表皮，根据GFP基因表达，将DREB6转录因子蛋白定位在了细胞核中。丁玉梅等构建了包含GFP基因的马铃薯质体表达载体．基因枪轰击马铃薯块茎，观察到GFP基因在块茎中的表达，并利用SDS-PAGE分析了GFP蛋白表达量。
3．3转基因植物叶片离体退绿检测
利用nptII基因作为筛选标记获得的转基因植株，可将叶片切成0．5 cmxl．0 cm的小段，放人300 mg/L的巴龙霉素溶液中．抽真空5 min，密封后在光照条件下放置4-5 d，阳性植株的叶片切段保持绿色，阴性植株的叶片切段退却绿色，可方便检测nptII等外源基因是否存在。
Cheng等利用该方法对农杆菌介导法获得的T0代转基因小麦植株进行了检测，叶片离体退绿检测结果与Southern
blot检测结果一致，证实了转基因植株的真实可靠性。叶兴国等参照Cheng等的方法对以nptII基因作为筛选标记获得的转基因小麦Tn代植株进行了检测，叶片离体退绿检测结果与PCR、ELISA、Southern blot检测结果吻合。
3．4植株活体检测
针对转基因植物含有的筛选标记，选用适宜的抗生素可对转基因植株进行涂抹、喷洒和灌心等检测。
3．4．1 转基因植物抗生素涂抹或喷洒检测
除草剂抗性基因bar是植物遗传转化研究广泛使用的选择标记之一，含bar基因的转基因植物对Basta、Liberty等除草剂具有抗性。Xing等、Shirley等以bar基因为筛选标记获得了大豆转基因植株，利用50x10~mg／L Liberty涂抹幼嫩叶片，鉴定了T0代阳性植株，初步筛选了T1代中的无标记基因植株。叶兴国等利用80x10-6 mg，L和50x10-6mg/L Liberty分别对获得的小麦转基因植株和大豆转基因植株进行了鉴定．确认GCE基因已转入小麦，VIPl基因已转入大豆。黄大年等将bar基因导入水稻恢复系，结合常规育种手段选育出具有抗除草剂特性的优良新恢复系，以此配制杂交组合。秧苗期喷施除草剂Basra后，具有抗性的真杂交稻正常生长，而假杂交稻和杂草被除草剂杀灭，在提高杂交稻纯度和优势的同时，也节约了劳动力。Zhou等将roundup基因转入了小麦．田问喷洒除草剂结果表明，转roundup基因小麦具有良好除草剂抗性。
新霉素磷酸转移酶基因nptlI和潮霉素基因是植物遗传转化研究另外2个主要选择标记。Cheng等_111在三叶期利用2％(w／V)巴龙霉素和0．2％吐温喷洒转nptII基因小麦植株，1周后观察巴龙霉素效果，转基因植株叶片上没有出现白色斑点,非转基因植株叶片上出现白色斑点。石东乔等将油酸脱饱和酶基因(Fad2基因)导入油菜，获得了转基因植株，利用适宜年度潮霉素溶液涂抹再生植株叶片，2-3 d后观察发现部分植株叶片上产生褐色斑点，另外一些植株的叶片上没有明显症状。
3．4．2转基因植物抗生素灌心检测
抗生素灌心是最新发展的检测玉米、高粱、甘蔗等高秆植物转基因植株的有效方法，具有不伤害植株正常生长的优点。Arlene等以农杆菌介导法和nptII基因为筛选标记获得了高粱抗性再生植株，苗期用移液器将20 txL含1．0 g，L卡那霉素、1．0g/L巴龙霉素、0．06％Silwet的抗生素溶液放入抗性再生植株心叶，3-5 d后观察新生叶片颜色变化，转基因植株叶片生长正常．非转基因植株叶片出现退绿条带。
3．5转基因植物ELISA检测
ELISA技术可准确、方便、快速鉴定转基因植株。1992年Roland等[蚓将ELISA技术用于转基因植物中nptII基因表达产物快速检测和定量分析。McKenzie等对检测nptII基因的ELISA技术进行了改进，提高了检测新霉素磷酸转移酶的灵敏性．可实用于多种转nptII基因植物的鉴定。Padgette等_41’建立了CP4 EPSPS基因编码产物的ELISA鉴定技术，在检测转基因大豆、小麦中CP4 EPSPS基因表达方面得到了成功运用。美国Agdia公司目前已生产了检测nptII、Bt等基因的ELISA试剂盒。本课题组利用Agdia公司试剂盒对转nptII等基因小麦植株、水稻植株、草坪草植株和芦荟植株进行了ELISA鉴定。Arlene等利用ELISA技术对转nptII基因高粱植株进行了鉴定。
3．6转基因植物Western blot检测
植物转基因的最终目的是在植物中表达外源蛋白质，表达产物以酶蛋白的形式参与植物代谢过程，或以转录因子蛋白形式调节内源功能基因转录，或以结构蛋白形式作为细胞组成物质或储藏物质。所以，在蛋白质水平对转基因植物进行分析鉴定是最具说服力的，由此发展了Western blot检测技术。Western blot实际上是一种蛋白质转移电泳技术，包括凝胶电泳、转移电泳、电泳转膜、抗体反应等步骤。Western blot具有从混杂抗原中检测出特定抗原或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体，以及蛋白质反应均一性好、固相膜保存时间长等优点，还可以对转移到膜上的蛋白质进行连续分析。
黄晓躁等将番茄花叶病毒移动蛋白基因的ToMVMP转化普通烟草，从PCR、Southern blot、Northern blot检测的阳性植株中提取总蛋白，利用ToMVMP多抗血清进行Western blot检测．表明MP基因已在烟草中正确表达，并获得能正义、反义表达ToMVMP基因的转基因植株。
4转基因植物检测技术评价和应用前景展望
利用各种手段分别在DNA、RNA、蛋白质等水平对转基因植物进行检测，每项检测技术均存在不同程度的缺陷。PCR检测虽是目前应用最为广泛的方法之一，理论上能检测所有转基因产品，但在扩增产物的凝胶电泳分析中常常出现假阳性现象。ELISA检测是一种特异性很强的蛋白检测方法，操作简单，反应灵敏，但无法检测不表达为蛋白的目的基因。在转基因研究中应用较多的报告基因是GUS，但对GUS进行组织学检测时．需要对材料进行固定、保温和脱色等处理，对植物材料具有破坏性，一些植物中存在GUS本底，影响GUS检测的准确性。GFP作为另一类报告基因，虽然灵敏度高，可以活体检测．表达不受生物类型、基因型、细胞和组织类型的限制．不需任何底物和外源辅助因子的参与，但需要价格昂贵的荧光显微镜。植株活体无伤害检测虽然方便、可靠，但适用的植物种类有限，也存在假阳性现象。Southern blot、Northern blot、Western blot等检测结果可靠、重复性好，但操作复杂．如Southern blot、Northern blot检测需要用同位素标记探针．Western blot检测需要制备抗体。所以，实际操作中应根据检测目的和要求选择合适的方法，可在对转基因植株进行PCR、ELISA、叶片涂抹除草剂等初步鉴定的基础上．进行Southern blot、Northern blot、Western blot等鉴定．分别检测功能基因的整合、转录和表达，这样可获得外源基因不同表达水平的信息，便于转基因植物产品准确检测及其推广。
作为生物技术革命前沿的转基因作物成为了全球关注的热点。农业转基因技术可保障农业的可持续发展，被看作解决世界温饱问题的潜在途径。为了确保中国粮食生产安全和提高中国农业科技水平的国际竞争力，中国政府近期已经批准了“转基因植物研究与产业化重大专项”实施方案．重要功能基因克隆、主要生物转基因新品种培育、转基因生物安全性研究等课题正在论证之中。转基因技术既给人类带来了巨大的经济效益，同时也引发了社会关于转基因植物安全性问题的争议。因此，建立和健全转基因作物检测技术体系是消除对转基因植物安全质疑的重要环节。其中．培育无筛选标记转基因植物及目标基因快速鉴定、时空表达、定点整合、花粉删除、质体转化和转基因新技术等是今后转基因植物的发展方向，不但有利于转基因植物安全性评价和商业化种植，而且有助于消除人类对转基因产品的担忧。
王瑾，唐益苗，赵昌平，叶兴国
(1．中国农业科学院作物科学研究所；2．东华大学化学化工与生物工程学院)
科技导报,2008年第26卷第23期总第269期